本試驗(yàn)旨在克隆植物乳桿菌DPP8膽鹽水解酶(BSH)基因并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行表達(dá),同時(shí)探討其酶學(xué)性質(zhì)。通過(guò)PCR技術(shù)克隆植物乳桿菌DPP8 BSH基因,然后將該基因重組到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a(+)中,獲得重組表達(dá)載體pET32a(+)-BSH,再將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中,通過(guò)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)BSH。采用�；撬針�(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定法對(duì)表達(dá)的BSH的活性進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示:本試驗(yàn)獲得了BSH基因全長(zhǎng)975 bp的序列,同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明成功獲得了BSH基因。對(duì)BSH表達(dá)產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示獲得了1條約為56 ku的蛋白條帶,與預(yù)期蛋白分子質(zhì)量大小相符。重組菌株在37℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h時(shí)BSH活性最高,可達(dá)22.81 U/mL。純化的BSH的最適反應(yīng)溫度為37℃,最適反應(yīng)pH為6.5,在40℃以下時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性,pH在3.0～9.0時(shí)可保持90%以上的活性。鎂離子(Mg²⁺)、鋁離子(Al³⁺)、三價(jià)鐵離子(...

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【部分圖文】：

圖1BSH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以植物乳桿菌DPP8全基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，如圖1所示，在約975bp處有1條特異性條帶，與預(yù)期大小相符。2.2克隆質(zhì)粒pMD18-BSH的鑒定結(jié)果

圖2質(zhì)粒pMD18-BSHPCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切鑒定

以pMD18-BSH質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出1條約為975bp的條帶（圖2中泳道1），與目的基因大小相符；將質(zhì)粒pMD18-BSH用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，在1.0%的瓊脂糖凝膠上顯示出2條條帶（圖2中泳道3），大小分別約為975和2692bp，結(jié)果與目的基因大小....

圖3基于Neighbor-Joining法構(gòu)建植物乳桿菌DPP8BSH基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

由圖4可知，重組質(zhì)粒pET32a(+)-BSH經(jīng)PCR擴(kuò)增出1條975bp的條帶，與目的條帶大小相符；經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后分別得到2條大小分別約為5900和975bp的條帶，經(jīng)EcoRⅠ單酶切得到1條大小約為6900bp條帶。上述結(jié)果說(shuō)明BSH基因已插入表達(dá)載....

圖4重組質(zhì)粒pET32a(+)-BSHPCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切鑒定

重組大腸桿菌經(jīng)不同時(shí)間誘導(dǎo)，分別取不同誘導(dǎo)時(shí)間的大腸桿菌裂解液，采用�；撬針�(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定法進(jìn)行BSH活性的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。重組菌株BL21/pET32a(+)-BSH在培養(yǎng)0～6h時(shí)BSH活性不斷升高，培養(yǎng)到6h時(shí)BSH活性達(dá)到最大值22.81U/mL，但在誘導(dǎo)4h后活性已....

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