本研究以腹瀉仔豬和健康仔豬的糞便樣品作為研究對象,通過比較細(xì)菌總DNA提取的不同方法,選取其中最佳方法提取腹瀉組和健康組樣品的細(xì)菌總DNA,使用PCR-DGGE技術(shù)對其菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化作比較研究,并采用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測了5種與腹瀉相關(guān)的腸道菌群的變化。 1、采集同一年齡段的斷奶健康仔豬和腹瀉仔豬新鮮糞樣,使用8種方法,即直酶法、間酶法、直勻法、間勻法、直碾法、間碾法、參考文獻(xiàn)提取DNA的方法和E.Z.N.A.TM Stool DNA Kit試劑盒,分別對其進(jìn)行細(xì)菌總DNA提取。然后比較這8種方法的優(yōu)劣。這8種提取方法,以直酶法提取的DNA得率最高,間勻法最低。通過比較分析,文獻(xiàn)法、直碾法、直酶法和間酶法存在大量23kb左右的大片段的基因組完整DNA,而幾乎所有樣品中還存在許多小片段的DNA。DGGE分析發(fā)現(xiàn),圖譜上顯示出的菌群種類在20～50之間,8種方法的DNA菌群種類大部分相同,且直碾法>間碾法=直酶法>間酶法=文獻(xiàn)法>直勻法>間勻法>試劑盒法,quantity one聚類分析,相似性在530%～96%之間。最后選取最適合本研究的DNA提取方法...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 引言
    1.2 腸道正常菌群
    1.3 腸道正常菌群的作用
        1.3.1 生物拮抗作用
        1.3.2 營養(yǎng)與消化作用
        1.3.3 免疫作用
        1.3.4 抗腫瘤作用
        1.3.5 治療菌群失調(diào)和抗生素相關(guān)性腹瀉
    1.4 仔豬腸道菌群的形成
    1.5 腸道菌群的分子生物學(xué)研究新技術(shù)
        1.5.1 限制性片斷長度多態(tài)性
        1.5.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)
        1.5.3 熒光原位雜交
        1.5.4 變性/溫度梯度凝膠電泳
        1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        1.5.6 高通量測序技術(shù)
    1.6 本研究的目的意義
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 樣品
        2.1.2 主要試驗(yàn)試劑
        2.1.3 主要試驗(yàn)儀器
    2.2 方法步驟
        2.2.1 8種方法提取糞便菌群總DNA
        2.2.2 細(xì)菌總DNA檢測
        2.2.3 兩組糞便樣品細(xì)菌總DNA的提取及多樣性比較
        2.2.4 腹瀉相關(guān)菌群的含量檢測
    2.3 數(shù)據(jù)整理分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 幾種不同方法對糞便菌群DNA提取效果
        3.1.1 DNA得率
        3.1.2 細(xì)菌總DNA的檢測
        3.1.3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖檢測
        3.1.4 DGGE指紋圖譜
    3.2 健康及腹瀉仔豬糞便菌群DGGE指紋圖譜
    3.3 測序結(jié)果
    3.4 糞便中5種菌群的含量
        3.4.1 熒光定量PCR產(chǎn)物特異性分析
        3.4.2 熒光定量PCR的優(yōu)化
        3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        3.4.4 熒光定量檢測兩組糞便菌群的差異
4 討論
    4.1 提取方法的比較
    4.2 PCR-DGGE技術(shù)分析動物糞便菌群多樣性的優(yōu)越性和局限性
    4.3 腹瀉仔豬和健康仔豬糞便菌群的比較
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3940672