DAZL (Deleted in Azoospermia-Like, DAZL)基因從生殖細(xì)胞發(fā)育早期開始表達(dá),并在減數(shù)分裂過程中持續(xù)存在,是啟動(dòng)減數(shù)分裂的內(nèi)因,在生殖細(xì)胞發(fā)育和分化過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。近年來,已有多篇關(guān)于DAZL基因在體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell,ESC)向雄性生殖細(xì)胞分化過程中起到重要作用的報(bào)道。但目前開展的ESCs誘導(dǎo)為生殖細(xì)胞的研究中,誘導(dǎo)劑眾多,誘導(dǎo)效率不一,因此在體外條件下如何選擇最適誘導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑組合以提高DAZL基因的表達(dá)量而誘導(dǎo)ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化就顯得尤為重要。本研究成功克隆了雞和小鼠DAZL基因啟動(dòng)子,通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)確定了DAZL基因啟動(dòng)子的核心活性調(diào)控區(qū),分析了DNA甲基化對DAZL基因啟動(dòng)子活性的影響,比較不同誘導(dǎo)劑對DAZL基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)效果并篩選出最適基因誘導(dǎo)劑及其組合。為研究在體外通過提高DAZL基因的表達(dá)而誘導(dǎo)ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化提供參考。獲得如下結(jié)果： 1.通過PCR方法首次克隆了蘇禽黃雞DAZL基因5’側(cè)翼區(qū)的-93～-39bp片段序列,成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pDAZL-...

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號表
主要儀器
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展
        1.1 胚胎干細(xì)胞
        1.2 生殖細(xì)胞
        1.3 胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
            1.3.1 胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法
            1.3.2 胚胎干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞分化的誘導(dǎo)
            1.3.3 胚胎干細(xì)胞向雌性生殖細(xì)胞分化的誘導(dǎo)
            1.3.4 胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的應(yīng)用前景
    2 DAZL基因的研究進(jìn)展
    3 真核基因啟動(dòng)子與基因表達(dá)
        3.1 真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)
        3.2 啟動(dòng)子與基因表達(dá)調(diào)控
        3.3 啟動(dòng)子功能的驗(yàn)證方法
    4 小鼠和雞作為模式動(dòng)物的特點(diǎn)
    參考文獻(xiàn)
第二章 雞DAZL基因核心啟動(dòng)子的鑒定
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
            1.1.4 常用試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 蘇禽黃雞睪丸組織基因組DNA的提取
            1.2.2 真核表達(dá)載體pDAZL-EGFP的構(gòu)建
            1.2.3 啟動(dòng)子缺失載體pLinker-EGFP的構(gòu)建
            1.2.4 蘇禽黃雞DAZL基因啟動(dòng)子活性定性分析
            1.2.5 DAZL基因核心啟動(dòng)子的鑒定
            1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    2 結(jié)果
        2.1 真核表達(dá)載體pDAZL-EGFP的構(gòu)建
        2.2 啟動(dòng)子缺失載體pLinker-EGFP的構(gòu)建
        2.3 蘇禽黃雞DAZL基因啟動(dòng)子活性定性分析
        2.4 DAZL基因核心啟動(dòng)子的鑒定
            2.4.1 雞DAZL基因啟動(dòng)子不同長度缺失片段的PCR擴(kuò)增
            2.4.2 系列缺失載體的構(gòu)建
            2.4.3 雞DAZL基因啟動(dòng)子核心區(qū)域鑒定
    3 討論
    4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第三章 雞DAZL基因DNA甲基化初步分析及誘導(dǎo)劑篩選
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
            1.1.4 常用試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 DNA甲基化狀態(tài)對DAZL基因啟動(dòng)子活性的影響
            1.2.2 睪丸組織提取液的制備
            1.2.3 誘導(dǎo)劑處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞
            1.2.4 雙熒光素酶活性檢測
            1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    2 結(jié)果
        2.1 DNA甲基化狀態(tài)對DAZL基因啟動(dòng)子活性的影響
            2.1.1 生物信息學(xué)預(yù)測DAZL基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島
            2.1.2 DAZL基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化位點(diǎn)定性分析
            2.1.3 重亞硫酸鹽測序
            2.1.4 DNA甲基化對雞DAZL基因啟動(dòng)子活性的影響
        2.2 雞DAZL基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑篩選
    3 討論
    4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第四章 DAZL基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑的通用性驗(yàn)證
    1 材料與方法
        1.1 材料與試劑
            1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
            1.1.4 常用試劑配制
        1.2 方法
            1.2.1 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子活性定性分析
            1.2.2 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子核心區(qū)域鑒定
            1.2.3 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子甲基化初步分析
            1.2.4 DAZL基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑作用效果驗(yàn)證
    2 結(jié)果
        2.1 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子活性定性分析
            2.1.1 真核表達(dá)載體pmDAZL-EGFP的構(gòu)建
            2.1.2 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子活性定性分析
        2.2 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子核心區(qū)域鑒定
            2.2.1 DAZL基因啟動(dòng)子5′端不同長度缺失片段的PCR擴(kuò)增
            2.2.2 系列缺失載體的構(gòu)建
            2.2.3 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子活性檢測
        2.3 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子甲基化初步分析
            2.3.1 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子CpG島區(qū)域預(yù)測
            2.3.2 小鼠DAZL基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化位點(diǎn)定性分析
            2.3.3 重亞硫酸鹽測序
            2.3.4 DNA甲基化對小鼠DAZL基因啟動(dòng)子活性的影響
        2.4 DAZL基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑作用效果驗(yàn)證
    3 討論
    4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表的論文



本文編號：3937931