豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起豬繁殖與呼吸綜合征,俗稱(chēng)“藍(lán)耳病”。該病1987年最早報(bào)道于美國(guó),1991在荷蘭分離到病毒,我國(guó)大陸哈爾濱獸醫(yī)研究所于1996年首次報(bào)道并分離到病原,目前該病流行于世界各養(yǎng)豬國(guó)家,給世界養(yǎng)豬也帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV不分節(jié)段單股正鏈的RNA病毒,為尼多目動(dòng)脈炎病毒屬,成熟病毒粒子直徑約50-60nm,有囊膜�；蚪M全長(zhǎng)約15kb,共有9個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)。ORF7編碼約15kDa的核衣殼(N)蛋白。N蛋白在病毒表達(dá)的蛋白中含量高,有4-5個(gè)抗原決定簇,免疫原性極強(qiáng),因此非常適合用于疾病診斷。 指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SLEXE)技術(shù)是上世紀(jì)九十年代產(chǎn)生的一種新型組合化學(xué)技術(shù)。應(yīng)用SELEX技術(shù)可以從一個(gè)大容量隨機(jī)寡聚核苷酸文庫(kù)中篩選針對(duì)靶物質(zhì)的親和性和特異性的適配子。本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選特異性針對(duì)PRRSV N蛋白的ssDNA適配子。通過(guò)測(cè)定適配子與N蛋白的親和性和專(zhuān)一性,評(píng)估適配子應(yīng)用于PRRSV的早期診...

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表（ABBREVIATION)
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 PRRSV目前研究進(jìn)展
    1.2 SELEX技術(shù)和適配子
        1.2.1 SELEX基本原理
        1.2.2 初始隨機(jī)核苷酸文庫(kù)
        1.2.3 靶物質(zhì)
        1.2.4 篩選過(guò)程
        1.2.5 次級(jí)文庫(kù)生成
        1.2.6 克隆和序列分析
        1.2.7 特異性和親和性分析
        1.2.8 適配子修飾
        1.2.9 SELEX技術(shù)和適配子的優(yōu)缺點(diǎn)
        1.2.10 適配子應(yīng)用及前景
第二章 研究目的和意義
第三章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 載體與質(zhì)粒
        3.1.2 工具酶與主要試劑
        3.1.3 主要緩沖液與相關(guān)試劑及其配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 PRRSV核衣殼蛋白的表達(dá)與純化
        3.2.2 初始隨機(jī)文庫(kù)的構(gòu)建及引物合成
        3.2.3 初始文庫(kù)通過(guò)PCR擴(kuò)增成雙鏈庫(kù)
        3.2.4 瓊脂糖凝膠電泳
        3.2.5 雙鏈文庫(kù)的回收
        3.2.6 不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增ssDNA文庫(kù)或生物素標(biāo)記的ssDNA文庫(kù)
        3.2.7 單鏈適配子文庫(kù)的回收
        3.2.8 N蛋白的ssDNA適配子篩選過(guò)程
        3.2.9 ssDNA亞庫(kù)親和性測(cè)定
        3.2.10 篩選產(chǎn)物的克隆及鑒定
        3.2.11 測(cè)序及序列分析
        3.2.12 適配子親和性和特異性
        3.2.13 適配子與PRRSV N蛋白的劑量依賴(lài)關(guān)系的確定
        3.2.14 適配子與PRRSV之間相互作用的鑒定
第四章 結(jié)果與分析
    4.1 PRRSV核衣殼蛋白的表達(dá)純化
    4.2 適配子初始文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定
    4.3 雙鏈文庫(kù)的生成及回收
    4.4 單鏈文庫(kù)的生成及回收
    4.5 適配子亞庫(kù)親和力測(cè)定
    4.6 篩選產(chǎn)物的克隆
    4.7 測(cè)序
    4.8 序列分析
        4.8.1 序列比對(duì)及堿基組成分析
        4.8.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
    4.9 適配子與N蛋白親和性分析
    4.10 抗原依賴(lài)性
    4.11 特異性分析
    4.12 適配子與PRRSV親和性鑒定
第五章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 PRRSV N蛋白的純化
        5.1.2 初始隨機(jī)寡聚核苷酸文庫(kù)構(gòu)建及引物設(shè)計(jì)
        5.1.3 次級(jí)文庫(kù)的生成
        5.1.4 篩選過(guò)程
        5.1.5 適配子序列分析
        5.1.6 適配子親和性和特異性分析
        5.1.7 適配子檢測(cè)病毒分析
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3935645