豬副流感病毒(porcine parainfluenza-5 virus,PPIV5)系不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒,為副粘病毒科,腮腺炎病毒屬成員之一。在1956年該病毒首次在猴體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)和被分離,并被命名為猴病毒5型(SV5),在1995年國際病毒學(xué)分類委員會上該病毒被正式命名為(simian parainfluenzavirus 5)。后該病毒在其他動物體內(nèi)及細(xì)胞培養(yǎng)物中均被檢測到,意味著猴并不是該病毒的唯一宿主,于是在2009年病毒學(xué)分類委員會上該病毒被首次命名為(parainfluenza virus 5,PIV5)。2018年國際病毒學(xué)委員會上將該病毒重新命名為(mammalian rubulavirus 5),本文中將使用PIV5表示副流感病毒。在本實驗室前期工作當(dāng)中,將該病毒做仔豬動物回歸實驗(詳細(xì)數(shù)據(jù)另行發(fā)表,未在本文中體現(xiàn)),結(jié)果表明該病毒雖然可感染豬腸道但不會導(dǎo)致腹瀉及體溫升高,盡本人所知無文獻報道該病毒會導(dǎo)致豬只嚴(yán)重疾病。故本研究目的為建立PPIV5的反向遺傳操作系統(tǒng),為作為遞送外源蛋白的載體奠定基礎(chǔ)。將分離到的PPIV5病毒命名為CHNJS-17株,根據(jù)Gen...

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 PPIV5 分類
    1.2 PPIV5 結(jié)構(gòu)
    1.3 PPIV5 蛋白功能
    1.4 PPIV5 基因組結(jié)構(gòu)
    1.5 副粘病毒感染細(xì)胞的方式
    1.6 副粘病毒反向遺傳操作系統(tǒng)研究進展
    1.7 負(fù)鏈RNA病毒作為載體疫苗進展
第二章 PPIV5 全基因組測序及序列分析
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞與毒株來源
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 參考毒株
    2.2 方法
        2.2.1 PPIV5 全基因組分段擴增引物設(shè)計與合成
        2.2.2 5'/3'RACE套式引物的設(shè)計與合成
        2.2.3 病毒繁殖、鑒定及RNA的提取
        2.2.4 病毒c DNA的合成
        2.2.5 病毒全基因組分段RT-PCR的建立
        2.2.6 病毒全基因組分段膠回收
        2.2.7 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.8 病毒全基因組的連接及轉(zhuǎn)化
        2.2.9 搖菌、重組質(zhì)粒的鑒定、提取及測序
        2.2.10 病毒RNA的 Poly(A)修飾及純化
        2.2.11 病毒5'、3'RACE反應(yīng)的建立
        2.2.12 PPIV5-F、HN基因的擴增
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 病毒在Vero上的增殖結(jié)果
        2.3.2 PPIV5的PCR鑒定結(jié)果
        2.3.3 PPIV5 的電鏡檢測結(jié)果
        2.3.4 病毒基因組分段擴增結(jié)果
        2.3.5 5'、3'RACE反應(yīng)建立的結(jié)果
        2.3.6 PPIV5 病毒的測序及拼接結(jié)果
        2.3.7 PPIV5-F、HN基因擴增結(jié)果
        2.3.8 PPIV5 病毒全基因核苷酸序列進化樹分析結(jié)果
        2.3.9 PPIV5 全基因苷酸序列同源性分析結(jié)果
        2.3.10 PPIV5 F基因進化樹分析結(jié)果
        2.3.11 PPIV5 HN進化樹基因分析結(jié)果
        2.3.12 PPIV5 F基因同源性分析結(jié)果
        2.3.13 PPIV5 HN基因同源性分析結(jié)果
    2.4 討論
第三章 PPIV5 反向遺傳全長的質(zhì)粒構(gòu)建及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、細(xì)胞、感受態(tài)細(xì)胞及載體
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要實驗儀器
    3.2 方法
        3.2.1 PPIV5 CHNJS-17 株全基因組感染性克隆的構(gòu)建
        3.2.2 全基因組載體選擇
        3.2.3 元件序列合成
        3.2.4 引物設(shè)計
        3.2.5 反應(yīng)體系
        3.2.6 PPIV5-C片段的克隆
        3.2.7 CHNJS-17 株輔助質(zhì)粒N/P/L的構(gòu)建引物設(shè)計
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 A和 D段擴增結(jié)果
        3.3.2 元件擴增結(jié)果
        3.3.3 ABCD段擴增結(jié)果
        3.3.4 PPIV5-ABD拼接結(jié)果
        3.3.5 全基因組拼接結(jié)果
        3.3.6 輔助質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
    3.4 討論
第四章 PPIV5 及表達(dá)EGFP的重組PPIV5 的拯救及鑒定
    4.1 材料
        4.1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑
    4.2 材料
        4.2.1 病毒拯救
        4.2.2 電鏡檢測
        4.2.3 間接免疫熒光及一步生長曲線檢測
        4.2.4 表達(dá)EGFP的重組PPIV5 的構(gòu)建策略
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 拯救的病毒粒子P1 代電鏡
        4.3.2 拯救的病毒粒子P10 代電鏡
        4.3.3 拯救的病毒粒子P10 代間接免疫熒光結(jié)果
        4.3.4 拯救的病毒粒子分子標(biāo)簽的檢測
        4.3.5 拯救的病毒第10 代一步生長曲線測定
        4.3.6 表達(dá)EGFP的重組PPIV5 的鑒定
    4.4 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻
致謝
個人簡歷
附錄



本文編號：3933972