豬圓環(huán)病毒2型(PCV2),一種單股環(huán)狀DNA病毒,是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的重要病原之一。PCV2的主要靶細胞是單核巨噬細胞系統(tǒng),其所引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征以淋巴細胞衰竭、炎性細胞浸潤為特征,造成機體的免疫功能抑制,繼而易引起其他細菌和病毒等病原體的繼發(fā)感染,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。 泛素蛋白酶體途徑是調(diào)節(jié)真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的重要途徑之一,除了降解細胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)外,其還參與調(diào)節(jié)細胞凋亡和分化、細胞周期進程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、炎性反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成等。鑒于泛素蛋白酶體途徑在細胞內(nèi)重要的生理學(xué)意義,很多病毒利用其來滿足自身需要,如病毒復(fù)制(包括病毒吸附、轉(zhuǎn)錄、翻譯、組裝和釋放)、病毒的免疫逃逸、癌癥進程、疾病過程等。目前PCV2感染和泛素蛋白酶體途徑的相互作用尚未見報道。 本研究首先驗證了感染PCV2的豬肺泡巨噬細胞差異蛋白質(zhì)的表達,然后從泛素蛋白酶體途徑著手,分析了泛素蛋白酶體途徑對PCV2復(fù)制的影響,以及泛素蛋白酶體途徑相關(guān)的差異蛋白質(zhì)(PSME1和PSMB2)在PCV2致病機理中的作用。具體研究內(nèi)容如下： 1.蛋白質(zhì)組學(xué)分析感染PCV2的豬肺泡巨噬細胞差異蛋白質(zhì)的驗...

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摘要
Abstract
縮略語表
第1章 文獻綜述
    1.1 豬圓環(huán)病毒概述
        1.1.1 PCV1
        1.1.2 PCV2
        1.1.3 PCV生物學(xué)特性
    1.2 PCV2基因組成
        1.2.1 PCV2基因結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PCV2蛋白質(zhì)功能
    1.3 病毒復(fù)制
        1.3.1 復(fù)制因子
            1.3.1.1 先導(dǎo)鏈復(fù)制原點
            1.3.1.2 REP復(fù)合物
    1.4 PCV2起源與演化
    1.5 PCV2的傳播途徑
    1.6 PCV2感染與臨床疾病
        1.6.1 豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病
            1.6.1.1 斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征
            1.6.1.2 豬皮炎腎病綜合征
            1.6.1.3 豬呼吸道疾病綜合征
            1.6.1.4 繁殖障礙
            1.6.1.5 肉芽腫性腸炎
            1.6.1.6 滲出性皮炎
            1.6.1.7 壞死性淋巴結(jié)炎
            1.6.1.8 先天性震顫
        1.6.2 與其他病原混合感染
    1.7 PCV2致病機理
        1.7.1 PCV2復(fù)制機理
        1.7.2 淋巴細胞衰竭和免疫抑制
            1.7.2.1 PCV2感染和凋亡
            1.7.2.2 PCV2毒力的基因決定性
            1.7.2.3 免疫增強誘發(fā)PCVAD
        1.7.3 與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用
            1.7.3.1 感染免疫細胞
            1.7.3.2 IL-10和其他細胞因子在PCV2感染中的作用
            1.7.3.3 病毒與宿主蛋白的相互作用
            1.7.3.4 病毒DNA與宿主蛋白的相互作用
    1.8 PCV2診斷
    1.9 PCV2疫苗研究進展
    1.10 泛素蛋白酶體途徑概述
    1.11 泛素蛋白酶體的組成元件
        1.11.1 泛素
        1.11.2 泛素蛋白酶體途徑相關(guān)的酶
            1.11.2.1 E1激活酶
            1.11.2.2 E2結(jié)合酶
            1.11.2.3 E3連接酶
            1.11.2.4 解離酶
        1.11.3 蛋白酶體
            1.11.3.1 蛋白酶體的結(jié)構(gòu)與作用機制
            1.11.3.2 蛋白酶體的細胞定位
        1.11.4 蛋白酶體激活物
            1.11.4.1 PA700
            1.11.4.2 PA28
            1.11.4.3 PA200
        1.11.5 蛋白酶體抑制劑
            1.11.5.1 化學(xué)合成的蛋白酶體抑制劑
            1.11.5.2 天然蛋白酶抑制劑
        1.11.6 靶蛋白泛素化和降解信號
    1.12 泛素蛋白酶體途徑的功能
        1.12.1 調(diào)節(jié)細胞周期
        1.12.2 癌癥和細胞存活
        1.12.3 炎性應(yīng)答
        1.12.4 免疫應(yīng)答
        1.12.5 蛋白的錯誤折疊
        1.12.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解
        1.12.7 疾病進程
第2章 研究目的與意義
第3章 實驗材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞、毒株與菌株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 主要培養(yǎng)基和溶液的配制
        3.1.4 主要試劑與試劑盒
        3.1.5 主要緩沖液與相關(guān)試劑的配制
        3.1.6 主要實驗器材
    3.2 實驗方法
        3.2.1 PCV2增殖
        3.2.2 細胞活力的測定
        3.2.3 病毒感染
        3.2.4 病毒DNA提取
        3.2.5 分子克隆技術(shù)
            3.2.5.1 PCR擴增
            3.2.5.2 PCR產(chǎn)物或酶切反應(yīng)的電泳檢測
            3.2.5.3 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的回收
            3.2.5.4 DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
            3.2.5.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)
            3.2.5.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.5.7 質(zhì)粒的制備與鑒定
            3.2.5.8 質(zhì)粒的大量制備
            3.2.5.9 質(zhì)粒DNA濃度的測定
        3.2.6 RNA提取
            3.2.6.1 細胞總RNA的提取
            3.2.6.2 DNase Ⅰ處理
            3.2.6.3 cDNA合成
        3.2.7 實時絕對熒光定量PCR
            3.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
            3.2.7.2 絕對熒光定量PCR
        3.2.8 實時相對熒光定量PCR
        3.2.9 轉(zhuǎn)染
        3.2.10 目的蛋白在真核細胞中表達的檢測(Western blot方法)
            3.2.10.1 細胞總蛋白的提取
            3.2.10.2 細胞核蛋白的提取
            3.2.10.3 SDS-PAGE電泳
            3.2.10.4 Western blot
        3.2.11 流式細胞術(shù)分析細胞周期和Sub-G1
        3.2.12 蛋白酶體活性的測定
        3.2.13 NF-κB熒光素酶活性檢測
        3.2.14 間接免疫熒光
        3.2.15 共聚焦技術(shù)
        3.2.16 熒光蛋白標(biāo)記的共定位
        3.2.17 統(tǒng)計學(xué)方法
第4章 實驗結(jié)果與分析
    4.1 感染PCV2豬肺泡巨噬細胞蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白的驗證
        4.1.1 PCV2感染及病毒滴度的測定
        4.1.2 差異蛋白的動態(tài)學(xué)變化
        4.1.3 差異蛋白的相對定量驗證
        4.1.4 差異蛋白的Western blot驗證
        4.1.5 差異蛋白β-tubulin與PCV2 ORF2共定位分析
    4.2 泛素蛋白酶體途徑對PCV2復(fù)制的影響
        4.2.1 細胞活力的測定
        4.2.2 蛋白酶體抑制劑影響PCV2復(fù)制
        4.2.3 蛋白酶體抑制劑對PCV2不同復(fù)制階段的影響
    4.3 蛋白酶體抑制劑對細胞周期的影響
    4.4 PCV2感染對泛素蛋白酶體途徑的影響
        4.4.1 PCV2感染促進細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泛素化
        4.4.2 PCV2感染對蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的影響
    4.5 針對泛素的siRNA降低PCV2增殖滴度
    4.6 泛素蛋白酶體途徑相關(guān)蛋白(PSME1和PSMB2)與PCV2的相互作用
        4.6.1 構(gòu)建真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2
            4.6.1.1 基因PSME1和PSMB2的擴增
            4.6.1.2 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2的構(gòu)建
            4.6.1.3 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2的鑒定
        4.6.2 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對PCV2復(fù)制的影響
            4.6.2.1 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對PCV2滴度的影響
            4.6.2.2 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2促進ORF2的表達
        4.6.3 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對NF-κB信號通路的作用
            4.6.3.1 pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對NF-κB熒光素酶活性的影響
            4.6.3.2 pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2誘導(dǎo)IκBα的降解和p65的核轉(zhuǎn)位
            4.6.3.3 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對炎性因子的影響
        4.6.4 NF-κB信號通路抑制劑BAY對PSMB2增強病毒滴度的影響
            4.6.4.1 BAY對細胞活力的影響
            4.6.4.2 BAY對轉(zhuǎn)染PSMB2 PK15細胞中PCV2滴度的影響
    4.7 PSME1、PSMB2與ORF2、ORF3的共定位
        4.7.1 熒光質(zhì)粒pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3和DsRed-PSME1、DsRed-PSMB2的擴增
        4.7.2 重組質(zhì)粒pEGFP-ORF2、ORF3和DsRed-PSME1、PSMB2的構(gòu)建
        4.7.3 熒光質(zhì)粒DsRed-PSME1、PSMB2和pEGFP-ORF2、ORF3的鑒定
        4.7.4 熒光質(zhì)粒pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3和DsRed-PSME1、DsRed-PSMB2的共定位
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 PCV2感染引起豬肺泡巨噬細胞功能變化
        5.1.2 泛素蛋白酶體途徑是PCV2早期有效復(fù)制所必需的
            5.1.2.1 抑制泛素蛋白酶體途徑降低PCV2滴度
            5.1.2.2 蛋白酶體抑制劑降低PCV2轉(zhuǎn)錄和翻譯
        5.1.3 泛素蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)細胞周期進程
        5.1.4 PCV2感染與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)
        5.1.5 PSME1調(diào)節(jié)細胞內(nèi)炎性因子
        5.1.6 PSMB2經(jīng)由NF-κB信號通路促進PCV2增殖
        5.1.7 泛素蛋白酶體途徑和豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病
    5.2 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3932516