發(fā)布時(shí)間：2024-03-10 10:02

　　三肽囊素(賴氨酰-組氨酰-甘氨酰胺，KHG-NH₂，Bursin)是一種從雞法氏囊中純化到的三肽物質(zhì)，具有誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的分化、提高機(jī)體抗體水平、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性、抑制細(xì)胞凋亡等作用。基于三肽囊素對(duì)畜禽的免疫增強(qiáng)作用，大量的研究集中于將其作為一種免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)，由于從禽法氏囊提取的數(shù)量有限、化學(xué)合成成本高等原因，難以在畜禽生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。本研究詣在研制高親和力三肽囊素單克隆抗體基礎(chǔ)上，從噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中篩選具有免疫增強(qiáng)活性的三肽囊素模擬表位，以期作為三肽囊素免疫增強(qiáng)活性的功能替代品在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 1.三肽囊素人工抗原的制備 三肽囊素分子上有多個(gè)氨基可用于與載體蛋白偶聯(lián)，載體蛋白與不同位置氨基偶聯(lián)制備的人工抗原免疫小鼠均可能獲得抗三肽囊素抗體，雖然大部分抗體適合用于建立三肽囊素的免疫學(xué)檢測(cè)方法，但以不同單抗為配體篩選的噬菌體模擬表位的生物學(xué)特性可能存在較大差異。 (1)分別采用EDC法和SMCC法將三肽囊素分子賴氨酰(K)上的氨基分別與載體蛋白(BSA、OVA)的羧基發(fā)生定向偶聯(lián)制備人工抗原BSA-KHG-NH₂、...

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 三肽囊素（Bursin）的研究進(jìn)展
        1.1.1 前言
        1.1.2 BF 形態(tài)學(xué)的研究簡(jiǎn)況
        1.1.3 法氏囊（BF）提取物中免疫活性因子研究進(jìn)展
        1.1.4 法氏囊三肽囊素（Bursin）的研究
    1.2 噬菌體展示技術(shù)的研究與進(jìn)展
        1.2.1 噬菌體表面展示技術(shù)的方法與發(fā)展
        1.2.2 噬菌體肽庫(kù)的應(yīng)用
第二章 三肽囊素人工抗原及其單克隆抗體的研制（一）
    2.1 主要試劑與材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 三肽囊素人工抗原的制備
        2.2.2 抗三肽囊素多克隆抗體的制備
        2.2.3 抗三肽囊素單克隆抗體的制備
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 三肽囊素人工抗原的制備
        2.3.2 免疫小鼠抗體效價(jià)及特異性測(cè)定
        2.3.3 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞篩選
        2.3.4 雜交瘤細(xì)胞亞克隆及上清抗體效價(jià)檢測(cè)
        2.3.5 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測(cè)
        2.3.6 單克隆抗體的大量制備和純化
        2.3.7 抗三肽囊素單克隆抗體特性測(cè)定
        2.3.8 三肽囊素間接競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線的建立
        2.3.9 加標(biāo)回收率的測(cè)定及雞法氏囊樣品中三肽囊素含量的檢測(cè)
    2.4 討論
        2.4.1 小分子半抗原與載體蛋白
        2.4.2 偶聯(lián)完全抗原的檢測(cè)
        2.4.3 小分子偶聯(lián)基團(tuán)的選擇
        2.4.4 細(xì)胞融合及培養(yǎng)
        2.4.5 雜交瘤細(xì)胞的檢測(cè)及亞克隆
        2.4.6 抗原的定向偶聯(lián)及不同雜交瘤細(xì)胞株間的差異
    2.5 小結(jié)
第三章 三肽囊素人工抗原及其單克隆抗體的研制（二）
    3.1 主要試劑與材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 三肽囊素人工抗原的合成
        3.2.2 三肽囊素多克隆抗體的制備
        3.2.3 三肽囊素單克隆抗體的制備
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 免疫小鼠抗原制備的鑒定
        3.3.2 三肽囊素多克隆抗體特異性檢測(cè)
        3.3.3 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞篩選
    3.4 討論
第四章 三肽囊素噬菌體模擬表位的篩選
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    4.2 方法
        4.2.1 受體菌 E.coli ER2738 生長(zhǎng)曲線的繪制
        4.2.2 Bursin 噬菌體七肽模擬表位淘洗
        4.2.3 噬菌體滴度的測(cè)定
        4.2.4 噬菌斑的擴(kuò)增與純化
        4.2.5 陽(yáng)性噬菌體克隆篩選
        4.2.6 陽(yáng)性噬菌體克隆的 DNA 模板提取
        4.2.7 28個(gè)噬菌體克隆滴度測(cè)定
        4.2.8 陽(yáng)性噬菌體克隆效價(jià)測(cè)定
        4.2.9 噬菌體間接競(jìng)爭(zhēng)曲線的繪制
        4.2.10 過(guò)濾后噬菌體滴度檢測(cè)
        4.2.11 陽(yáng)性噬菌體對(duì) P35 雜交瘤細(xì)胞抗體分泌的影響
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 受體菌 E.coli ER2738 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果
        4.3.2 親和淘洗結(jié)果
        4.3.3 噬菌體的擴(kuò)增與純化
        4.3.4 噬菌體克隆陽(yáng)性篩選結(jié)果
        4.3.5 噬菌體單鏈 DNA 提取
        4.3.6 噬菌體克隆滴度測(cè)定結(jié)果
        4.3.7 方陣滴定法測(cè)定結(jié)果
        4.3.8 噬菌體抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果
        4.3.9 陽(yáng)性噬菌體克隆特性測(cè)定
        4.3.10 過(guò)濾后噬菌體滴度的測(cè)定結(jié)果
        4.3.11 P35 單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及細(xì)胞濃度的摸索
        4.3.12 陽(yáng)性噬菌體對(duì)雜交瘤抗體分泌的影響
    4.4 討論
        4.4.1 抗三肽囊素單克隆抗體 2D2 七肽模擬表位的篩選
        4.4.2 競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法鑒定特異性結(jié)合肽的活性
        4.4.3 三肽囊素及其它幾種合成肽對(duì)雜交瘤抗體分泌影響
        4.4.4 噬菌體對(duì)雜交瘤細(xì)胞抗體分泌的影響
    4.5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3924623