發(fā)布時(shí)間：2017-05-24 17:28

  本文關(guān)鍵詞：乳腺上皮細(xì)胞細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的構(gòu)建和活性檢測(cè)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乳腺炎是由于細(xì)菌或者真菌等病原微生物感染乳腺組織而引發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)。乳腺炎不僅影響了山羊的健康,也對(duì)產(chǎn)奶量以及奶質(zhì)量造成影響,對(duì)畜牧業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。白介素-1作為一種細(xì)胞因子,在調(diào)控炎癥反應(yīng)中起重要作用,其啟動(dòng)子在細(xì)菌刺激條件下可以誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。高效特異性表達(dá)的啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)基因抗乳腺炎研究領(lǐng)域的關(guān)鍵因素。Bce1(β-casein element 1)為一條長(zhǎng)為160bp的牛酪蛋白增強(qiáng)子,它含有催乳素依賴性的調(diào)控作用的應(yīng)答元件并參與催乳素介導(dǎo)的調(diào)控。BCE1通過對(duì)催乳素介導(dǎo)的調(diào)控增加啟動(dòng)子的上皮細(xì)胞機(jī)制的依賴性,從而可能會(huì)影響啟動(dòng)子的組織特異性表達(dá)功能。本實(shí)驗(yàn)將Bce1置于白介素IL-1α啟動(dòng)子的上游,從而組成一個(gè)更加有效的乳腺上皮細(xì)胞細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本文較系統(tǒng)地研究了Bce1增強(qiáng)子對(duì)IL-1α啟動(dòng)子的組織特異性調(diào)控作用,比較了其在人胚腎細(xì)胞(Human embryonic kidney 293T cell,HEK-293T)、奶山羊肺上皮細(xì)胞(Lung epithelial cell,GLEC)以及奶山羊乳腺上皮細(xì)胞(Mammary epithelial cell,GMEC)中的表達(dá),初步證明了該啟動(dòng)子的活性以及組織特異性。結(jié)果如下:(1)分別使用LPS(Lipopolysaccharide,脂多糖)對(duì)原代山羊乳腺上皮細(xì)胞處理0、2、4、6、8、10 h,通過RT-qPCR定量試驗(yàn)檢測(cè)不同處理時(shí)長(zhǎng)IL-1α基因mRNA的表達(dá)量,并發(fā)現(xiàn)在6 h時(shí)表達(dá)量有明顯的升高(P0.05)。初步驗(yàn)證了IL-1α基因在山羊乳腺上皮細(xì)胞中的細(xì)菌誘導(dǎo)活性。(2)利用高保真PCR方法從奶山羊基因組克隆奶山羊IL-1α啟動(dòng)子(1587bp),從�；蚪M上克隆牛酪蛋白Bce1增強(qiáng)子序列(160bp)。經(jīng)酶切鑒定,成功構(gòu)建了具有表達(dá)功能的pGL4.10-IL1α和pGL4.10-IL1α-Bce1的真核表達(dá)載體。同時(shí)使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)證明從奶山羊基因組上擴(kuò)增得到的IL-1α啟動(dòng)子片段具有活性,且具有細(xì)菌誘導(dǎo)性。(3)構(gòu)建出山羊乳腺組織特異性的細(xì)菌誘導(dǎo)型真核表達(dá)載體,并通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明,Bce1對(duì)IL-1α啟動(dòng)子的組織特異性調(diào)控在LPS誘導(dǎo)后得到體現(xiàn),具體表現(xiàn)為,在GMEC組中,真核表達(dá)載體pGL4.10-ILα1-Bce1在LPS攻菌組的表達(dá)量明顯高于PBS處理組(P0.05);LPS處理后,真核表達(dá)載體pGL4.10-ILα1-Bce1在GMEC中表達(dá)量相對(duì)于pGL4.10-ILα1有顯著提升,而在GLEC和293T上表達(dá)量并沒有升高(P0.05),這表明成功構(gòu)建了組織特異性細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本研究成功克隆了IL-1α啟動(dòng)子序列和牛酪蛋白增強(qiáng)子Bce1序列;并以pGL4.10為骨架,構(gòu)建雙熒光報(bào)告載體pGL4.10-IL1α和pG4.10-IL1α-Bce1,證明啟動(dòng)子IL-1α的細(xì)菌誘導(dǎo)性以及Bce1介導(dǎo)的IL-1α啟動(dòng)子所產(chǎn)生的組織特異性表達(dá)。本研究為提高臨床奶山羊乳腺炎防治技術(shù)奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牛酪蛋白增強(qiáng)子 白介素-1 乳腺組織特異性 細(xì)菌誘導(dǎo)型 山羊乳腺上皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.27
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1.1 乳腺炎研究進(jìn)展12-13
• 1.1.1 乳腺炎的發(fā)展史12
• 1.1.2 乳腺炎的分類12-13
• 1.1.3 乳腺炎的危害13
• 1.2 乳腺炎的預(yù)防與治療13-15
• 1.2.1 衛(wèi)生管理13
• 1.2.2 疫苗接種13
• 1.2.3 產(chǎn)前擠奶13-14
• 1.2.4 蚊蟲控制14
• 1.2.5 交叉哺乳14
• 1.2.6 防止或減少乳腺水腫的影響14-15
• 1.2.7 綜合管理措施15
• 1.3 抗乳腺炎基因的研究進(jìn)展15-19
• 1.3.1 可溶性因子16-18
• 1.3.2 細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子18
• 1.3.3 組織特異型啟動(dòng)子18-19
• 1.4 牛β酪蛋白基因19-22
• 1.4.1 牛β酪蛋白基因簡(jiǎn)介19
• 1.4.2 牛β酪蛋白增強(qiáng)子19-22
• 1.5 小結(jié)22-24
• 第二章 脂多糖刺激山羊乳腺上皮細(xì)胞中的IL-1αmRNA表達(dá)水平檢測(cè)24-29
• 2.1 材料和試劑24
• 2.1.1 材料24
• 2.1.2 試劑24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-27
• 2.2.1 山羊乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)24-25
• 2.2.2 LPS處理細(xì)胞25
• 2.2.3 cDNA的制備和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)（real-time PCR）25-27
• 2.3 結(jié)果27-28
• 2.4 討論28
• 2.5 小結(jié)28-29
• 第三章 細(xì)菌誘導(dǎo)型熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建及功能驗(yàn)證29-39
• 3.1 材料和試劑29
• 3.1.1 材料29
• 3.1.2 試劑29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法29-35
• 3.2.1 載體構(gòu)建29-34
• 3.2.2 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞34
• 3.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試34-35
• 3.3 結(jié)果35-38
• 3.3.1 IL1-α啟動(dòng)子和Bce1增強(qiáng)子的擴(kuò)增和真核表達(dá)載體構(gòu)建35-37
• 3.3.2 真核表達(dá)載體的功能驗(yàn)證37-38
• 3.4 討論38
• 3.5 小結(jié)38-39
• 第四章 嵌合啟動(dòng)子組織特異性細(xì)菌誘導(dǎo)活性的檢測(cè)39-45
• 4.1 材料和試劑39
• 4.1.1 材料39
• 4.1.2 試劑39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法39-40
• 4.2.1 山羊乳腺上皮細(xì)胞和山羊肺上皮細(xì)胞細(xì)胞的原代培養(yǎng)39-40
• 4.2.2 不同載體分別轉(zhuǎn)染GMEC和GLEC40
• 4.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試40
• 4.3 結(jié)果40-43
• 4.3.1 真核表達(dá)載體在GMEC的表達(dá)40-41
• 4.3.2 真核表達(dá)載體在GLEC的表達(dá)41-42
• 4.3.3 真核表達(dá)載體在HEK293T細(xì)胞的表達(dá)42-43
• 4.4 討論43-44
• 4.5 小結(jié)44-45
• 全文結(jié)論45-46
• 展望以及進(jìn)一步研究46-47
• 參考文獻(xiàn)47-56
• 附錄56-60
• 縮略詞60-61
• 致謝61-62
• 作者簡(jiǎn)介62

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6 符梅;熊顯榮;高川;李宇;王樹茂;李鍵;;麥洼牦牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2012年11期

7 郝明超;劉r

本文編號(hào)：391498