動物衣原體病是由各類衣原體感染哺乳動物、禽類和人所引起的一類疾病的總稱。因該類疾病對養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展、動物產(chǎn)品進出口貿(mào)易和人類健康等公共衛(wèi)生領(lǐng)域易造成巨大的經(jīng)濟損失,故而對該類疾病的研究越發(fā)受到相關(guān)部門和國內(nèi)外學(xué)者的重視。傳統(tǒng)衣原體診斷方法存在檢測時間長、對操作人員和儀器設(shè)備要求高、檢測靈敏度有限以及檢測衣原體種類范圍有限而導(dǎo)致漏檢的不足,故亟需建立一種快速準(zhǔn)確的衣原體診斷方法。 本研究采用新型核酸擴增技術(shù),即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù),建立衣原體通用檢測方法。根據(jù)LAMP反應(yīng)原理,針對衣原體共有特定的保守區(qū)域設(shè)計通用的2對基因的內(nèi)、外引物和1對環(huán)引物。使用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀對反應(yīng)進程中的濁度實時監(jiān)控,對影響LAMP反應(yīng)效率的重要參數(shù)(反應(yīng)溫度和內(nèi)引物濃度)進行優(yōu)化,確定本方法的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。通過特異性試驗和靈敏度試驗對本方法的特異性和靈敏度進行探索；利用同一批次和不同批次提取的標(biāo)準(zhǔn)株沙眼衣原體DNA驗證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性；添加特殊的染料...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞表
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 衣原體概況
        1.1.1 生物學(xué)特性
            1.1.1.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)與生長周期
            1.1.1.2 培養(yǎng)特性
            1.1.1.3 抗原和感染機制
            1.1.1.4 抵抗力
        1.1.2 衣原體流行病學(xué)特點
        1.1.3 衣原體病理學(xué)研究進展
        1.1.4 衣原體基因組的研究
        1.1.5 衣原體蛋白組學(xué)的研究
    1.2 衣原體診斷技術(shù)研究進展
    1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)
        1.3.1 引物設(shè)計
        1.3.2 LAMP反應(yīng)原理
        1.3.3 LAMP方法特點
        1.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的應(yīng)用
        1.3.5 LAMP方法與其他方法的聯(lián)合應(yīng)用
    1.4 研究目的及意義
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 試驗毒株
        2.1.2 主要儀器設(shè)備與試劑
    2.2 方法
        2.2.1 衣原體序列分析及LAMP引物設(shè)計
        2.2.2 衣原體的增殖培養(yǎng)
        2.2.3 衣原體基因組提取及其基因組的鑒定
        2.2.4 衣原體通用LAMP檢測體系的建立及優(yōu)化
            2.2.4.1 引物驗證
            2.2.4.2 溫度優(yōu)化
            2.2.4.3 內(nèi)引物優(yōu)化
        2.2.5 LAMP特異性試驗
        2.2.6 LAMP靈敏度試驗
        2.2.7 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗
        2.2.8 LAMP目測法的建立
            2.2.8.1 目測法特異性驗證
            2.2.8.2 目測法靈敏度試驗
        2.2.9 與其他四種分子生物學(xué)方法比較試驗
            2.2.9.1 五種檢測方法特異性及衣原體檢測范圍的比較
            2.2.9.2 LAMP方法的敏感度與3種PCR檢測方法進行比較
            2.2.9.3 LAMP方法及3種PCR方法用于臨床樣本檢測的比較
第三章 試驗結(jié)果
    3.1 衣原體基因組序列分析及LAMP引物設(shè)計
    3.2 衣原體基因組的鑒定
    3.3 衣原體通用LAMP檢測體系的建立及優(yōu)化
        3.3.1 引物驗證
        3.3.2 溫度優(yōu)化
        3.3.3 內(nèi)引物濃度優(yōu)化
    3.4 LAMP特異性試驗
    3.5 LAMP靈敏度試驗
    3.6 LAMP重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗
    3.7 衣原體LAMP目測法的建立及與LA-320C儀器檢測結(jié)果比較
        3.7.1 目測法特異性試驗
        3.7.2 目測法靈敏度試驗
    3.8 衣原體通用LAMP檢測方法與文獻報道的4種分子生物學(xué)方法比較試驗
        3.8.1 LAMP及4種PCR方法特異性比較試驗
        3.8.2 LAMP與3種PCR檢測方法靈敏度比較試驗
        3.8.3 應(yīng)用于臨床檢測的比較
第四章 討論
    4.1 衣原體通用LAMP檢測方法的建立
    4.2 衣原體通用LAMP目測法的建立
    4.3 通用LAMP方法與4種其他學(xué)檢測方法的比較
    4.4 方法的進一步完善
    4.5 后續(xù)工作建議
    4.6 展望
第五章 結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表文章、參與的科研項目情況



本文編號：3911851