本試驗(yàn)旨在建立準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)布魯菌、羊種布魯菌、牛種布魯菌的方法。以BCSP31作為布魯菌菌屬特異性基因,以IS711插入元件作為布魯菌菌種特異性標(biāo)志,設(shè)計(jì)布魯菌、羊種布魯菌、牛種布魯菌的特異性引物和Taqman探針,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒模板,優(yōu)化了多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件,并將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒10倍倍比稀釋作多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,評(píng)價(jià)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的敏感性、特異性、重復(fù)性,建立了鑒別牛羊種布魯菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,并用此方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：引物濃度400nM,探針濃度200nM,退火溫度60℃為所建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的最佳反應(yīng)體系和條件。此診斷方法可以特異地檢測(cè)布魯菌、牛布魯菌、羊布魯菌,不與其它革蘭氏陰性細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng),特別是與布魯菌有強(qiáng)烈交叉反應(yīng)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O：9,表明其具有良好的特異性。另外,此診斷方法Cq值的變異系數(shù)均小于0.05,檢測(cè)限為2.8fg～3.2fg,表明其具有良好的可靠性、穩(wěn)定性及較高的敏感性。運(yùn)用已建立的診斷方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),其可以準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)布魯菌、羊種布魯菌、牛種布魯菌。

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖3多重實(shí)時(shí)熒光PCR敏感性分析

圖13種菌的目的片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

菌的引物和探針的檢測(cè)限分別為3.0、2.8、3.2fg，其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別為-3.259、-3.258、-3.258，相關(guān)系數(shù)均為1，并有良好的線性關(guān)系。因此，可以根據(jù)所檢測(cè)臨床樣品的Cq值，并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線可對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。2.3特異性試驗(yàn)結(jié)果將豬種、羊種、牛種布魯菌菌....

圖23種菌的重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果

系。因此，可以根據(jù)所檢測(cè)臨床樣品的Cq值，并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線可對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。2.3特異性試驗(yàn)結(jié)果將豬種、羊種、牛種布魯菌菌30002500200015001000500010203040圖3多重實(shí)時(shí)熒光PCR敏感性分析相對(duì)熒光單位布魯菌羊種布魯菌牛種布魯菌循環(huán)數(shù)1：M.DNA標(biāo)....

圖6。2.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果使用已建立的多重實(shí)時(shí)熒光010203040圖6多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

株的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒模板DNA各2μL同時(shí)加入多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。另外，將7株非布魯菌菌株（小腸結(jié)腸耶爾森菌O：9、禽巴氏桿菌、乳酸菌、大腸桿菌O8、大腸桿菌O78、大腸桿菌O86、馬流產(chǎn)沙門氏菌）的模板DNA、陰性對(duì)照（無(wú)菌水代替模板）各2μL分別加入多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR....

本文編號(hào)：3911589