通過抽提接毒豬瘟病毒(CSFV)的PK-15細(xì)胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并與pMD18-T載體連接,再通過雙酶切法將UBCH6基因與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、真核表達(dá)載體pcDNA3.0連接。重組原核表達(dá)載體pGEX-UBCH6用感受態(tài)細(xì)胞BL21轉(zhuǎn)化,并在低溫條件下,用低濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)UBCH6重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時UBCH6表達(dá)效果最好,而且UBCH6重組蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表達(dá)。UBCH6重組蛋白經(jīng)過Ni-NTA純化后與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等體積混合乳化并免疫4周齡昆明小鼠,從而制備出UBCH6多克隆抗體,重組真核表達(dá)載體pcDNA3.0-UBCH6以化學(xué)轉(zhuǎn)染人工脂質(zhì)體法導(dǎo)入293T細(xì)胞中,Western blot檢測制備的UBCH6多克隆抗體能與真核表達(dá)細(xì)胞蛋白發(fā)生反應(yīng),反應(yīng)效價可達(dá)1∶10 000,反應(yīng)性良好。Western blot檢測UBCH6多克隆抗體的特異性,ISG15多克隆抗體、UBCH6多克隆抗體都能與接毒CSFV、轉(zhuǎn)染Pol...

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圖1豬UBCH6基因編碼的氨基酸親水性和抗原指數(shù)分析

對GenBank上收錄的豬UBCH6基因序列(登錄號:XM-021071421.1)全長1500bp,編碼多肽的親疏水性進(jìn)行分析,選取編碼親水性良好且有線性表位的194個氨基酸的基因片段(圖1)作為目的蛋白制備多克隆抗體。2.2豬UBCH6基因的擴(kuò)增

圖2PCR擴(kuò)增UBCH6基因電泳圖

原核重組質(zhì)粒pGEX-UBCH6用感受態(tài)細(xì)胞BL21轉(zhuǎn)化,分別用含0.05mmol/L、0.5mmol/LIPTG和不加IPTG的LB培養(yǎng)液,誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。取未誘導(dǎo)重組菌菌液及誘導(dǎo)的菌液各1mL離心,菌體處理后用于SDS-PAGE電泳。誘導(dǎo)的重組菌超聲波破碎裂解,分別....

圖3重組原核、真核表達(dá)載體雙酶切鑒定

圖2PCR擴(kuò)增UBCH6基因電泳圖2.5原核重組蛋白的純化與鑒定

圖4SDS-PAGE和Westernblot分析重組菌原核表達(dá)的UBCH6蛋白

用稀釋比例為1∶500的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體通過Westernblot方法檢測UBCH6的真核表達(dá),結(jié)果如圖6所示,重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-UBCH6在293T細(xì)胞中成功表達(dá)UBCH6蛋白。圖5純化UBCH6重組蛋白分析

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