豬傳染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)引起豬的一種高度傳染性呼吸道疾病，又稱(chēng)為豬接觸性傳染性胸膜肺炎。該致病菌引起的主要病癥為肺出血、壞死和纖維素性滲出等。該病于1957年首次報(bào)道，自報(bào)道以來(lái)該病已在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并給許多國(guó)家的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)該病治療的越早，經(jīng)濟(jì)損失也越少的特點(diǎn)，建立一種快速、靈敏、高效的診斷方法已成為新的研究熱點(diǎn)。 本研究根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，可以特異性擴(kuò)增出637bp和431bp的目的片段。運(yùn)用多重PCR技術(shù)，建立一種檢測(cè)豬胸膜肺炎放線桿菌的方法。結(jié)果顯示，已知的胸膜肺炎放線桿菌血清1型、3型、5a型、8型、10型均能擴(kuò)增出特異性的目的片段。特異性檢驗(yàn)時(shí)，血清型5a能擴(kuò)增出目的片段，而其他對(duì)照細(xì)菌均未擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段；根據(jù)該多重PCR方法對(duì)臨床分離的通過(guò)生理生化分析鑒定的5株疑似豬胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行了分子鑒定，其中有4株鑒定為豬胸膜肺炎放...

【文章頁(yè)數(shù)】：80 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 引言
    1.1 豬傳染性胸膜肺炎
    1.2 病原學(xué)
    1.3 流行病學(xué)
    1.4 致病機(jī)理及其危害
        1.4.1 致病機(jī)理
        1.4.2 豬傳染性胸膜肺炎的危害
    1.5 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌主要毒力因子
        1.5.1 溶血毒素（Apx）
        1.5.2 外膜蛋白（Omp）
        1.5.3 莢膜多糖（CPS）
        1.5.4 脂多糖（LPS）
        1.5.5 其他毒力因子
    1.6 診斷方法
        1.6.1 病原學(xué)方法
        1.6.2 血清型方法
        1.6.3 分子學(xué)診斷方法
    1.7 豬傳染性胸膜肺炎的防制
    1.8 研究目的及意義
第二章 豬胸膜肺炎放線桿菌 PCR 檢測(cè)方法的建立、藥敏試驗(yàn)及 MIC 值的測(cè)定
    2.1 PCR 診斷方法的建立
        2.1.1 培養(yǎng)基及菌株
        2.1.2 酶類(lèi)及主要試劑
        2.1.3 引物設(shè)計(jì)
        2.1.4 App 基因組提取
        2.1.5 PCR 擴(kuò)增
        2.1.6 App PCR 特異性檢測(cè)
        2.1.7 App PCR 敏感性檢測(cè)
        2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)
    2.2 藥敏試驗(yàn)及 MIC 值的測(cè)定
        2.2.1 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)菌株
        2.2.2 主要器材
        2.2.3 試驗(yàn)用藥及藥敏片制備
        2.2.4 藥品原液制備及保存
        2.2.5 菌株的活化及菌液制備
        2.2.6 藥敏試驗(yàn)
        2.2.7 MIC 的測(cè)定
        2.2.8 結(jié)果判定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 App 標(biāo)準(zhǔn)菌株 PCR 擴(kuò)增
        2.3.2 App PCR 擴(kuò)增特異性試驗(yàn)
        2.3.3 App 的敏感性試驗(yàn)
        2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)
        2.3.5 建立的 PCR 方法對(duì)臨床分離菌株的鑒定
        2.3.6 藥敏試驗(yàn)
        2.3.7 MIC 的測(cè)定結(jié)果
    2.4 討論
        2.4.1 PCR 診斷方法的建立
        2.4.2 藥敏試驗(yàn)及 MIC 值的測(cè)定
第三章 毒力因子 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 基因片段的克隆
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株和載體
        3.1.2 儀器及試劑
        3.1.3 工具酶及主要試劑配制
    3.2 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 片段的擴(kuò)增與克隆
        3.2.1 基因組 DNA 的提取
        3.2.2 基因的擴(kuò)增
        3.2.3 PCR 產(chǎn)物電泳及純化
        3.2.4 PCR 產(chǎn)物與 pMD18-T 載體的連接
        3.2.5 感受態(tài)細(xì)胞制備
        3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性菌落的鑒定
        3.2.7 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的提取
        3.2.8 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒序列測(cè)定
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 ApxⅠC、ApxⅡA、 OmpD15 基因片段的克隆結(jié)果
        3.4.2 測(cè)序結(jié)果
    3.5 討論
第四章 OmpD15 的原核表達(dá)及其抗原性分析
    4.1 OmpD15 基因的原核表達(dá)
        4.1.1 工具酶及主要試劑配制
        4.1.2 OmpD15 的基因擴(kuò)增
        4.1.3 目的片段和載體的酶切、電泳及回收
        4.1.4 基因 OmpD15 的連接與轉(zhuǎn)化
        4.1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的提取與酶切鑒定
        4.1.6 pET32a-OmpD15 重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.1.7 pET32a-OmpD15 重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析
        4.1.8 pET32a-OmpD15 重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物初步純化
        4.1.9 pET32a-OmpD15 重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的抗原性分析
    4.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 最小致死量（MLD）的測(cè)定
        4.2.4 抗體的監(jiān)測(cè)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 OmpD15 基因的擴(kuò)增
        4.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的提取與酶切鑒定
        4.3.3 pET32a-OmpD15 重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析
        4.3.4 pET32a-OmpD15 重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物初步純化
        4.3.5 pET32a-OmpD15 重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的抗原性分析
        4.3.6 最小致死量（MLD）的測(cè)定
        4.3.7 抗體的監(jiān)測(cè)
    4.4 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
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本文編號(hào)：3906905