核因子κB受體活化因子配體(RANKL)是腫瘤壞死因子家族的重要成員之一,除了在骨免疫學(xué)中發(fā)揮重要作用外,其在黏膜免疫尤其是在調(diào)控M細胞的分化等方面日益受到科學(xué)家們的高度關(guān)注,而M細胞是腸道黏膜免疫的關(guān)鍵門戶。基于此,本研究在體外表達豬源RANKL,純化后分析其生物學(xué)功能,以期為提高豬腸道黏膜免疫應(yīng)答提供科學(xué)依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。為獲得生物學(xué)活性良好的豬RANKL蛋白,本研究采用昆蟲/桿狀病毒真核表達系統(tǒng)。首先將豬RANKL基因克隆到pFastBacHTA載體后,經(jīng)PCR鑒定和雙酶切驗證以及序列測定,最終獲得正確的pFastBacHTA-RANKL重組質(zhì)粒。隨后將重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-RANKL轉(zhuǎn)化至DH10BAC高效感受態(tài)細胞制備桿粒,經(jīng)兩輪藍白斑篩選,選取白色菌落進行擴大培養(yǎng),采用PCR鑒定,結(jié)果表明本試驗成功構(gòu)建了表達豬RANKL的重組桿粒。將重組桿粒轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲細胞后,觀察細胞病變,收獲細胞并裂解后采用SDS-PAGE、Western-bloting以及IFA驗證目標蛋白的表達狀況,結(jié)果表明重組桿狀病毒能夠正確表達豬RANKL蛋白。將接毒后的sf9細胞進行超聲裂解,...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1桿狀病毒復(fù)制周期示意圖

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論9因此，由于其宿主的特殊性和對環(huán)境和人類健康的安全性，桿狀病毒已成功地用作殺蟲劑(Chambersetal.,2018)。桿狀病毒的基本形態(tài)為桿狀、有囊膜，囊膜中含有豐富的類脂質(zhì)和蛋白酶類，但包含體型病毒粒子的囊膜無表面突起。包裹在囊膜中的為病....

圖2-1豬、人、雞大鼠和小鼠RANKL氨基酸序列進化樹

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章表達豬RANKL蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定19圖2-1豬、人、雞大鼠和小鼠RANKL氨基酸序列進化樹Fig.2-1Aphylogenetictreeoftheaminoacidsequencesforporcine,human,chicken,r....

圖2-2豬RANKL基因克隆

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章表達豬RANKL蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定20CD圖2-2豬RANKL基因克隆Fig.2-2PorcineRANKLgenecloningA從pEasyBluntzero-RANKL質(zhì)粒中成功擴增出RANKL基因B，C構(gòu)建的pFastBacHTA....

圖2-3重組桿粒藍白斑篩選結(jié)果

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章表達豬RANKL蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定20CD圖2-2豬RANKL基因克隆Fig.2-2PorcineRANKLgenecloningA從pEasyBluntzero-RANKL質(zhì)粒中成功擴增出RANKL基因B，C構(gòu)建的pFastBacHTA....

本文編號：3901277