Sox2是SOX基因(SRY-related high mobility group box,SOX)家族的一個(gè)成員,也是體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。Sox2除了能夠維持胚胎干細(xì)胞的自發(fā)復(fù)制、增殖和多能性外,同時(shí)也參與神經(jīng)祖細(xì)胞和內(nèi)胚層等多種細(xì)胞的增殖和分化。為了探索Sox2在牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程過程中的作用,本論文通過在牛胎兒成纖維細(xì)胞中過表達(dá)Sox2基因,研究其對(duì)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程過程早期階段的影響。首先培養(yǎng)原代牛胎兒成纖維細(xì)胞,之后通過細(xì)胞活力測(cè)定、以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和核型分析等方法,確認(rèn)牛胎兒成纖維細(xì)胞可以用于本研究。然后通過PCR分別克隆了牛Sox2基因和Puro基因,將其連接到pGEFP-N2基礎(chǔ)載體上,構(gòu)建得到兩種表達(dá)載體:pEGFP-N2-Puro、pEGFP-N2-Sox2-T2A-Puro-T2A,這兩個(gè)表達(dá)載體可同時(shí)表達(dá)GFP和Puro或者Sox2、Puro和GFP,分別用于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。在此基礎(chǔ)上,通過電轉(zhuǎn)染的方式將兩種載體分別導(dǎo)入牛胎兒成纖維細(xì)胞,然后通過嘌呤霉素(Puromycin)藥物篩選得到兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將轉(zhuǎn)入pEGFP...

【文章頁(yè)數(shù)】：101 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 綜述
    1.1 胚胎干細(xì)胞
        1.1.1 胚胎干細(xì)胞的定義
        1.1.2 小鼠胚胎干細(xì)胞的研究歷史
        1.1.3 牛胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展
    1.2 誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞
        1.2.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞概述
        1.2.2 體細(xì)胞重編程過程中的間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化
        1.2.3 家畜誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展
    1.3 Sox2 在胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的作用
        1.3.1 轉(zhuǎn)錄因子Sox2 的結(jié)構(gòu)
        1.3.2 Sox2 在胚胎干細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育中的作用
        1.3.3 Sox2 在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的作用
    1.4 展望
    1.5 研究目的與意義
第二章 牛胎兒成纖維細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        2.2.1 試劑和材料
        2.2.2 儀器和設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 牛胎兒成纖維細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)
        2.3.2 牛胎兒成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的研究
        2.3.3 牛胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素耐受性的檢測(cè)
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 牛胎兒成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)
        2.4.2 牛胎兒成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的研究
        2.4.3 牛胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素耐受性的檢測(cè)
    2.5 小結(jié)
    2.6 討論
第三章 牛Sox2 啟動(dòng)子真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        3.2.1 試劑和材料
        3.2.2 儀器和設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 Sox2 表達(dá)載體構(gòu)建流程圖
        3.3.2 真核表達(dá)載體pEGFP-N2-Puro的構(gòu)建
        3.3.3 真核表達(dá)載體pEGFP-N2-Sox2-T2A-Puro-T2A的構(gòu)建
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 克隆Puro基因的結(jié)果
        3.4.2 構(gòu)建p GEM-T-Puro-T2A載體的結(jié)果及鑒定
        3.4.3 構(gòu)建p EGFP-N2-Puro載體的結(jié)果及鑒定
        3.4.4 克隆牛Sox2 基因的結(jié)果
        3.4.5 構(gòu)建p GEM-T-Sox2-T2A的結(jié)果及鑒定
        3.4.6 真核表達(dá)型重組質(zhì)粒pEGFP-N2-Sox2-T2A-Puro-T2A的構(gòu)建結(jié)果及鑒定
    3.5 小結(jié)
    3.6 討論
第四章 過表達(dá)Sox2 對(duì)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程作用的研究
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        4.2.1 試劑和材料
        4.2.2 儀器和設(shè)備
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 牛胎兒成纖維細(xì)胞的外源基因轉(zhuǎn)染
        4.3.2 陽(yáng)性細(xì)胞篩選
        4.3.3 牛胎兒成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)
        4.3.4 誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程過程中的生物學(xué)分析
        4.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 電轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞及陽(yáng)性細(xì)胞篩選結(jié)果
        4.4.2 誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程過程的形態(tài)圖
        4.4.3 誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程過程中的生物學(xué)分析結(jié)果
    4.5 小結(jié)
    4.6 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    1 縮略詞表
    2 重要溶液配制
致謝



本文編號(hào)：3899345