Sox2是SOX基因(SRY-related high mobility group box,SOX)家族的一個成員,也是體細胞重編程為多能干細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。Sox2除了能夠維持胚胎干細胞的自發(fā)復(fù)制、增殖和多能性外,同時也參與神經(jīng)祖細胞和內(nèi)胚層等多種細胞的增殖和分化。為了探索Sox2在牛胎兒成纖維細胞重編程過程中的作用,本論文通過在牛胎兒成纖維細胞中過表達Sox2基因,研究其對牛胎兒成纖維細胞重編程過程早期階段的影響。首先培養(yǎng)原代牛胎兒成纖維細胞,之后通過細胞活力測定、以及成纖維細胞生長曲線和核型分析等方法,確認牛胎兒成纖維細胞可以用于本研究。然后通過PCR分別克隆了牛Sox2基因和Puro基因,將其連接到pGEFP-N2基礎(chǔ)載體上,構(gòu)建得到兩種表達載體:pEGFP-N2-Puro、pEGFP-N2-Sox2-T2A-Puro-T2A,這兩個表達載體可同時表達GFP和Puro或者Sox2、Puro和GFP,分別用于對照組和實驗組。在此基礎(chǔ)上,通過電轉(zhuǎn)染的方式將兩種載體分別導(dǎo)入牛胎兒成纖維細胞,然后通過嘌呤霉素(Puromycin)藥物篩選得到兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。將轉(zhuǎn)入pEGFP...

【文章頁數(shù)】：101 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 綜述
    1.1 胚胎干細胞
        1.1.1 胚胎干細胞的定義
        1.1.2 小鼠胚胎干細胞的研究歷史
        1.1.3 牛胚胎干細胞的研究進展
    1.2 誘導(dǎo)多能性干細胞
        1.2.1 誘導(dǎo)多能干細胞概述
        1.2.2 體細胞重編程過程中的間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化
        1.2.3 家畜誘導(dǎo)多能干細胞的研究進展
    1.3 Sox2 在胚胎干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞中的作用
        1.3.1 轉(zhuǎn)錄因子Sox2 的結(jié)構(gòu)
        1.3.2 Sox2 在胚胎干細胞及早期胚胎發(fā)育中的作用
        1.3.3 Sox2 在誘導(dǎo)多能干細胞中的作用
    1.4 展望
    1.5 研究目的與意義
第二章 牛胎兒成纖維細胞的分離與體外培養(yǎng)
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與設(shè)備
        2.2.1 試劑和材料
        2.2.2 儀器和設(shè)備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 牛胎兒成纖維細胞的分離與體外培養(yǎng)
        2.3.2 牛胎兒成纖維細胞生物學(xué)特性的研究
        2.3.3 牛胎兒成纖維細胞對嘌呤霉素耐受性的檢測
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 牛胎兒成纖維細胞體外培養(yǎng)
        2.4.2 牛胎兒成纖維細胞生物學(xué)特性的研究
        2.4.3 牛胎兒成纖維細胞對嘌呤霉素耐受性的檢測
    2.5 小結(jié)
    2.6 討論
第三章 牛Sox2 啟動子真核表達載體的構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與設(shè)備
        3.2.1 試劑和材料
        3.2.2 儀器和設(shè)備
    3.3 實驗方法
        3.3.1 Sox2 表達載體構(gòu)建流程圖
        3.3.2 真核表達載體pEGFP-N2-Puro的構(gòu)建
        3.3.3 真核表達載體pEGFP-N2-Sox2-T2A-Puro-T2A的構(gòu)建
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 克隆Puro基因的結(jié)果
        3.4.2 構(gòu)建p GEM-T-Puro-T2A載體的結(jié)果及鑒定
        3.4.3 構(gòu)建p EGFP-N2-Puro載體的結(jié)果及鑒定
        3.4.4 克隆牛Sox2 基因的結(jié)果
        3.4.5 構(gòu)建p GEM-T-Sox2-T2A的結(jié)果及鑒定
        3.4.6 真核表達型重組質(zhì)粒pEGFP-N2-Sox2-T2A-Puro-T2A的構(gòu)建結(jié)果及鑒定
    3.5 小結(jié)
    3.6 討論
第四章 過表達Sox2 對牛胎兒成纖維細胞重編程作用的研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與設(shè)備
        4.2.1 試劑和材料
        4.2.2 儀器和設(shè)備
    4.3 實驗方法
        4.3.1 牛胎兒成纖維細胞的外源基因轉(zhuǎn)染
        4.3.2 陽性細胞篩選
        4.3.3 牛胎兒成纖維細胞的誘導(dǎo)
        4.3.4 誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細胞重編程過程中的生物學(xué)分析
        4.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 電轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細胞及陽性細胞篩選結(jié)果
        4.4.2 誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細胞重編程過程的形態(tài)圖
        4.4.3 誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細胞重編程過程中的生物學(xué)分析結(jié)果
    4.5 小結(jié)
    4.6 討論
結(jié)論
參考文獻
附錄
    1 縮略詞表
    2 重要溶液配制
致謝



本文編號：3899345