旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因編輯技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌aroA基因的敲除系統(tǒng),并分析其對不同大腸桿菌aroA基因敲除、修復(fù)的差異。首先構(gòu)建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9載體;隨后人工設(shè)計同源修復(fù)供體基因序列,并亞克隆到CRISPR/Cas 9載體中,構(gòu)建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除體系;將該系統(tǒng)分別應(yīng)用到大腸桿菌DH10B、DH5α和JM109細胞中,PCR鑒定篩選到的陽性菌株,并回收其擴增條帶進行克隆、測序。CRISPR/Cas 9載體的酶切與測序結(jié)果均正確,表明載體構(gòu)建成功;PCR鑒定結(jié)果顯示,該系統(tǒng)對三種大腸桿菌均能進行aroA基因的有效敲除,敲除效率為46%⁵8%;測序結(jié)果進一步證實目的基因敲除成功。本試驗成功構(gòu)建大腸桿菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系統(tǒng),為進一步研究致病菌aroA基因功能及開發(fā)減毒大腸桿菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

【文章頁數(shù)】：9 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 菌株和質(zhì)粒
    1.2 主要試劑
    1.3 sgRNA的設(shè)計和相關(guān)引物的合成
    1.4 sgRNA載體的構(gòu)建
    1.5 aroA基因同源臂(Donor)載體的構(gòu)建
    1.6 含sgRNA及aroA基因同源臂載體的構(gòu)建
    1.7 感受態(tài)細胞制備及細菌的轉(zhuǎn)化
    1.8 穩(wěn)定敲除aroA基因的DH5α、DH10B、JM109菌株的篩選
2 結(jié)果
    2.1 sgRNA載體的構(gòu)建
    2.2 aroA基因同源臂載體的構(gòu)建
    2.3 psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor載體的構(gòu)建
    2.4 對不同大腸桿菌aroA基因敲除效率的檢測
3 討論
4 結(jié)論



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