根據肝螺桿菌和肺炎克雷伯氏菌的16S rRNA基因序列,設計兩對特異性引物進行多重PCR擴增,同時優(yōu)化退火溫度和引物濃度,篩選出最優(yōu)反應條件組合。結果表明這兩對引物能夠在417bp和368bp處擴增出目標條帶,且特異性高。PCR擴增的最佳退火溫度為54.4℃。肝螺桿菌和肺炎克雷伯氏菌的最佳引物濃度均為40 nmol/L。在上述條件下同時檢測肝螺桿菌和肺炎克雷伯氏菌DNA的敏感度為1pg,從反應體系的配制到檢測完畢所需時間為4h。本實驗建立的多重PCR可以同時檢測肝螺桿菌和肺炎克雷伯氏菌,本方法具有快速、特異性強、效率以及準確率高的優(yōu)點,為同時快速檢測上述兩種細菌奠定了良好的基礎。

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【學位級別】：碩士

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第一章 文獻綜述
    1. 肺炎克雷伯菌研究進展
        1.1 肺炎克雷伯氏菌分布特點
        1.2 肺炎克雷伯氏菌的特點
        1.3 肺炎克雷伯氏菌感染途徑和易感因素
        1.4 肺炎克雷伯氏菌感染的癥狀及特點
        1.5 肺炎克雷伯氏菌感染的診斷和治療
        1.6 肺炎克雷伯氏菌耐藥機制研究進展
    2. 肝螺桿菌的研究進展
        2.1 肝螺桿菌的發(fā)現與分類
        2.2 肝螺桿菌的理化性質
        2.3 肝螺桿菌的流行病學特征
        2.4 肝螺桿菌的傳播途徑
        2.5 肝螺桿菌的致病機制
        2.6 肝螺桿菌與相關疾病研究進展
        2.7 肝螺桿菌檢測研究進展
第二章 肝螺桿菌和肺炎克雷伯氏菌多重PCR檢測方法的建立
    1. 前言
    2. 材料與方法
        2.1 試驗儀器
        2.2 菌株來源
        2.3 主要試劑
        2.4 試劑的配制
    3. 實驗方法
        3.1 菌種復蘇
        3.2 細菌形態(tài)學觀察及革蘭氏染色
        3.3 生化反應鑒定
        3.4 細菌基因組DNA提取
        3.5 細菌DNA電泳
        3.6 細菌DNA濃度測定
        3.7 普通PCR擴增
        3.8 20μl多重PCR擴增體系
        3.9 多重PCR擴增條件
        3.10 瓊脂糖凝膠的制備
        3.11 電泳膠的制備
        3.12 PCR產物的電泳檢測
        3.13 PCR擴增片段的回收
        3.14 DNA片段測序
        3.15 多重PCR條件的優(yōu)化
        3.16 多重PCR引物特異性檢測
        3.17 單重PCR敏感度檢測
        3.18 多重PCR敏感度檢測
    4. 實驗結果
        4.1 菌種復蘇結果
        4.2 革蘭氏染色結果
        4.3 細菌生化反應結果
        4.4 細菌基因組 DNA 電泳
        4.5 細菌基因組DNA濃度測定結果
        4.6 引物擴增效果
        4.7 兩種細菌擴增片段測序結果
        4.8 多重PCR條件優(yōu)化結果
        4.9 多重PCR引物特異性檢測結果
        4.10 單一 PCR 敏感度檢測結果
        4.11 多重 PCR 敏感度檢測結果
    5. 討論
    6. 本章小結
第三章 結束語
    1.1 主要工作與創(chuàng)新點
    1.2 后續(xù)研究工作
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文



本文編號：3893629