偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病,該病的病原是偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)。PRV可以感染多種家畜和野生動(dòng)物,豬是其天然宿主。近年來(lái),疫苗的應(yīng)用使偽狂犬病得到了有效控制,美國(guó)及部分歐洲國(guó)家甚至根除了該病。2012年,我國(guó)報(bào)道了多個(gè)接種偽狂犬病Bartha-K61株疫苗的豬場(chǎng)暴發(fā)了偽狂犬病新疫情。研究發(fā)現(xiàn),引起此次疫情的PRV毒株發(fā)生了多處變異,與經(jīng)典毒株屬于不同的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分支,且對(duì)宿主的致病力增強(qiáng)。目前關(guān)于新的PRV流行毒株致病力增強(qiáng)的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚,而且毒株具有繼續(xù)變異的可能。因此,有必要建立快速評(píng)估PRV毒株致病力的方法。本研究利用同源重組法構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)NLuc熒光素酶的重組PRV(rPRVTJ-NLuc),并對(duì)該重組病毒的穩(wěn)定性、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)以及熒光素酶活性進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定,結(jié)果表明,與親本毒株相比,重組病毒可以表達(dá)紅色熒光蛋白,其在PK-15細(xì)胞上具有傳代穩(wěn)定性,且其在PK-15細(xì)胞上的復(fù)制能力沒(méi)有發(fā)生明顯改變,能夠表達(dá)較高水平的熒光素酶,且熒光素酶水平與病毒滴度呈正相關(guān)。將該重組病毒rPRVTJ...

【文章頁(yè)數(shù)】：45 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖2.1表達(dá)NLuc的重組PRV的構(gòu)建策略Fig.2.1SchematicrepresentationoftherecombinantPRVexpressingNLucluciferase

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文如圖2.1所示的重組病毒的構(gòu)建策略，根據(jù)PRVTJ（GenBank序列號(hào)：KJ789182）US區(qū)設(shè)計(jì)左右同源臂引物P1F/P1R、P2F/P2R（表2.1）。以PRVTJ基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得位于US9基因兩側(cè)的....

圖2.3重組病毒的蝕斑形成與熒光表達(dá)Fig.2.3PlaquesformationandredfluorescenceexpressionofrPRVTJ-NLuc

定測(cè)序正確的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，24h后即可觀察到明顯00×），表明成功構(gòu)建了能夠表達(dá)DsRed的轉(zhuǎn)移載體。圖2.2轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞24h后的熒光表達(dá).2.2Redfluorescenceexpressionofthetra....

圖2.2轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞24h后的熒光表達(dá)Fig.2.2RedfluorescenceexpressionofthetransfervectorinVerocells24hposttransfection

24h后即可觀察到明顯的紅色熒光（圖2.2，放大倍數(shù)200×），表明成功構(gòu)建了能夠表達(dá)DsRed的轉(zhuǎn)移載體。圖2.2轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞24h后的熒光表達(dá)Fig.2.2Redfluorescenceexpressionofthetran....

圖2.4重組病毒的PCR鑒定

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文將重組病毒在PK-15細(xì)胞中連續(xù)傳代至第20代，提取第1、5、15、20代的病毒基因組，利用引物P4F/P4R、P7F/P7R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定重組病毒各代次中報(bào)告基因NLuc與DsRed的穩(wěn)定性。NLuc與DsRed....

本文編號(hào)：3892342