哺乳動(dòng)物精卵融合是精子和卵子上多種蛋白相互作用介導(dǎo)完成的。但這些蛋白在精卵融合過程中的具體作用還不清楚。經(jīng)基因敲除小鼠模型鑒定,精子上的IZUMO家族成員IZUMO1和睪丸特異性絲氨酸蘇氨酸激酶TSSK6是精卵融合所必需的蛋白。IZUMO家族有四個(gè)成員,其中IZUMO1、IZUMO2和IZUMO3是睪丸特異性表達(dá)的膜蛋白,而IZUMO4是睪丸和其它組織均表達(dá)的可溶性蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期用酵母雙雜交、哺乳動(dòng)物雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)在分子水平上鑒定發(fā)現(xiàn)綿羊TSSK6既能與IZUMO1結(jié)合也能與IZUMO4結(jié)合,但這三種蛋白在綿羊精子細(xì)胞上是否結(jié)合?什么時(shí)候、什么部位結(jié)合?還需要進(jìn)一步鑒定。本實(shí)驗(yàn)擬用間接免疫熒光技術(shù)研究TSSK6與IZUMO1和IZUMO4在綿羊精子上的共定位,從而進(jìn)一步確定這三種蛋白在細(xì)胞水平是否結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)首先克隆了綿羊Tssk6、Izumo1和Izumo4的cDNA編碼區(qū),分別插入到pGEX-4T-1質(zhì)粒構(gòu)建了pGEX-Tssk6、pGEX-Izumo1和pGEX-Izumo4原核表達(dá)載體,分別在大腸桿菌中表達(dá)了GST-TSSK6、GST-IZUMO1和GST-IZUM...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

圖2.1鑒定羊TSSK6與IZUMO1和IZUMO4在精子上共定位的技術(shù)路線

圖2.5pGEX-Tssk6重組載體的構(gòu)建過程

圖2.8綿羊Izumo1、Izumo4cDNAPCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2.10綿羊pMD-Izumo1、pMD-Izumo4重組載體雙酶切瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

本文編號(hào)：3884303