喹賽多作為一種新型的飼料添加劑具有良好的促生長(zhǎng)作用,與喹噁啉類其它藥物相比,喹賽多毒性作用很低。喹賽多在體內(nèi)可被代謝成多種化合物,其中主要代謝物有cy1、cy4、cy6、cy12。迄今為止,仍然不明確喹賽多與代謝物的活性大小。所以有必要對(duì)喹賽多及其代謝物的活性大小進(jìn)行比較,進(jìn)而篩選出活性化合物,這對(duì)理解喹賽多的藥理與毒理作用機(jī)理具有重要的意義。 藥物活性化合物篩選指標(biāo)的選擇成為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,通過文獻(xiàn)調(diào)研并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)喹賽多的實(shí)際研究進(jìn)展情況,最終確定以EGF mRNA的表達(dá)作為喹賽多藥理活性成分篩選的指標(biāo)；以化合物與細(xì)胞孵育后對(duì)細(xì)胞活力的影響作為喹賽多毒理活性成分的指標(biāo)。 1喹賽多的藥理活性成分篩選 采用RT-qPCR技術(shù),首先測(cè)定不同濃度的喹賽多與細(xì)胞孵育不同時(shí)間后EGF的表達(dá),以篩選出喹賽多與細(xì)胞作用后EGF mRNA上調(diào)表達(dá)的最佳濃度與時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果顯示,2μM喹賽多與細(xì)胞孵育1h后EGF mRNA的表達(dá)量與空白組相比上調(diào)2倍。喹賽多代謝物與細(xì)胞孵育后EGF mRNA上調(diào)倍數(shù)不如喹賽多顯著,在所有代謝物中cy12對(duì)EGF的上調(diào)作用最明顯,達(dá)到了1.3倍,cy6其次,cyl最低。所以...

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 喹賽多藥理與毒理作用機(jī)制研究進(jìn)展
        1.1.2 細(xì)胞模型用于藥物篩選的研究進(jìn)展
    1.2 研究?jī)?nèi)容
    1.3 研究思路
    1.4 研究意義
2 材料和方法
    2.1 細(xì)胞株
    2.2 藥品和試劑
    2.3 主要儀器和設(shè)備
    2.4 溶液配制
    2.5 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代和凍存
    2.6 總RNA的提取
    2.7 總RNA純度及完整性的檢測(cè)
    2.8 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
    2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平
    2.10 Western Blot實(shí)驗(yàn)
        2.10.1 細(xì)胞蛋白提取及蛋白濃度測(cè)定
        2.10.2 SDS-PAGE電泳
        2.10.3 Western blot
    2.11 細(xì)胞活力的檢測(cè)
        2.11.1 MTT法檢測(cè)喹嗯啉類代謝物對(duì)L02細(xì)胞的活力影響
        2.11.2 乳酸脫氫酶(LDH)釋放測(cè)定
        2.11.3 細(xì)胞內(nèi)自由基(ROS)釋放測(cè)定
        2.11.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
    2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 總RNA質(zhì)量
    3.2 喹賽多及其代謝物對(duì)EGF基因表達(dá)的時(shí)效量效關(guān)系
        3.2.1 喹賽多對(duì)EGF基因表達(dá)的時(shí)效量效關(guān)系分析
        3.2.2 喹賽多的主要代謝物對(duì)EGF mRNA表達(dá)的影響
        3.2.3 PI3K-Akt通路對(duì)EGF表達(dá)的調(diào)控
    3.3 2μM喹賽多與細(xì)胞孵育后對(duì)ROS釋放的影響
    3.4 2gM喹賽多對(duì)FOXO1和P53 mRNA和蛋白表達(dá)的影響
    3.5 2gM喹賽多對(duì)cyclin D1表達(dá)的影響
    3.6 喹賽多及其代謝物對(duì)L02細(xì)胞劑量及時(shí)間依賴性毒性作用
    3.7 喹嗯啉類代謝物對(duì)L02細(xì)胞中LDH釋放的影響
    3.8 喹賽多及其代謝物對(duì)ROS釋放的影響
    3.9 100μM喹賽多對(duì)FOXO1和P53表達(dá)的影響
    3.10 喹賽多與EGF和FOXO1及p53表達(dá)的量效關(guān)系
    3.11 100MM喹賽多對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
4 討論
    4.1 喹賽多及其代謝物藥理與毒理活性大小
    4.2 喹賽多促進(jìn)ROS釋放的時(shí)效量效及與Akt激活間的關(guān)系
    4.3 P53表達(dá)的量效關(guān)系以及p53表達(dá)和Akt激活間的關(guān)系
    4.4 FOXO1的量效關(guān)系以及FOXO1與Akt激活之間的關(guān)系
    4.5 喹賽多的藥理與毒理作用機(jī)理
5 全文總結(jié)
6 文獻(xiàn)綜述
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
    附錄Ⅰ---研究生簡(jiǎn)介
    附錄Ⅱ--實(shí)時(shí)熒光PCR各基因擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線分析結(jié)果
    附錄Ⅲ-實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的步驟
    附錄Ⅳ-實(shí)驗(yàn)過程中RNA的提取步驟
    附錄Ⅴ-BCA標(biāo)曲的測(cè)定
    對(duì)各答辯委員的答復(fù)書



本文編號(hào)：3880219