喹賽多作為一種新型的飼料添加劑具有良好的促生長作用,與喹噁啉類其它藥物相比,喹賽多毒性作用很低。喹賽多在體內(nèi)可被代謝成多種化合物,其中主要代謝物有cy1、cy4、cy6、cy12。迄今為止,仍然不明確喹賽多與代謝物的活性大小。所以有必要對喹賽多及其代謝物的活性大小進行比較,進而篩選出活性化合物,這對理解喹賽多的藥理與毒理作用機理具有重要的意義。 藥物活性化合物篩選指標的選擇成為實驗的關(guān)鍵,通過文獻調(diào)研并結(jié)合本實驗室對喹賽多的實際研究進展情況,最終確定以EGF mRNA的表達作為喹賽多藥理活性成分篩選的指標；以化合物與細胞孵育后對細胞活力的影響作為喹賽多毒理活性成分的指標。 1喹賽多的藥理活性成分篩選 采用RT-qPCR技術(shù),首先測定不同濃度的喹賽多與細胞孵育不同時間后EGF的表達,以篩選出喹賽多與細胞作用后EGF mRNA上調(diào)表達的最佳濃度與時間點。結(jié)果顯示,2μM喹賽多與細胞孵育1h后EGF mRNA的表達量與空白組相比上調(diào)2倍。喹賽多代謝物與細胞孵育后EGF mRNA上調(diào)倍數(shù)不如喹賽多顯著,在所有代謝物中cy12對EGF的上調(diào)作用最明顯,達到了1.3倍,cy6其次,cyl最低。所以...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 喹賽多藥理與毒理作用機制研究進展
        1.1.2 細胞模型用于藥物篩選的研究進展
    1.2 研究內(nèi)容
    1.3 研究思路
    1.4 研究意義
2 材料和方法
    2.1 細胞株
    2.2 藥品和試劑
    2.3 主要儀器和設(shè)備
    2.4 溶液配制
    2.5 細胞的復(fù)蘇、傳代和凍存
    2.6 總RNA的提取
    2.7 總RNA純度及完整性的檢測
    2.8 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
    2.9 實時熒光定量PCR檢測目的基因mRNA表達水平
    2.10 Western Blot實驗
        2.10.1 細胞蛋白提取及蛋白濃度測定
        2.10.2 SDS-PAGE電泳
        2.10.3 Western blot
    2.11 細胞活力的檢測
        2.11.1 MTT法檢測喹嗯啉類代謝物對L02細胞的活力影響
        2.11.2 乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定
        2.11.3 細胞內(nèi)自由基(ROS)釋放測定
        2.11.4 細胞凋亡的檢測
    2.12 統(tǒng)計學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 總RNA質(zhì)量
    3.2 喹賽多及其代謝物對EGF基因表達的時效量效關(guān)系
        3.2.1 喹賽多對EGF基因表達的時效量效關(guān)系分析
        3.2.2 喹賽多的主要代謝物對EGF mRNA表達的影響
        3.2.3 PI3K-Akt通路對EGF表達的調(diào)控
    3.3 2μM喹賽多與細胞孵育后對ROS釋放的影響
    3.4 2gM喹賽多對FOXO1和P53 mRNA和蛋白表達的影響
    3.5 2gM喹賽多對cyclin D1表達的影響
    3.6 喹賽多及其代謝物對L02細胞劑量及時間依賴性毒性作用
    3.7 喹嗯啉類代謝物對L02細胞中LDH釋放的影響
    3.8 喹賽多及其代謝物對ROS釋放的影響
    3.9 100μM喹賽多對FOXO1和P53表達的影響
    3.10 喹賽多與EGF和FOXO1及p53表達的量效關(guān)系
    3.11 100MM喹賽多對細胞凋亡的影響
4 討論
    4.1 喹賽多及其代謝物藥理與毒理活性大小
    4.2 喹賽多促進ROS釋放的時效量效及與Akt激活間的關(guān)系
    4.3 P53表達的量效關(guān)系以及p53表達和Akt激活間的關(guān)系
    4.4 FOXO1的量效關(guān)系以及FOXO1與Akt激活之間的關(guān)系
    4.5 喹賽多的藥理與毒理作用機理
5 全文總結(jié)
6 文獻綜述
參考文獻
致謝
附錄
    附錄Ⅰ---研究生簡介
    附錄Ⅱ--實時熒光PCR各基因擴增產(chǎn)物的溶解曲線分析結(jié)果
    附錄Ⅲ-實驗過程中細胞培養(yǎng)的步驟
    附錄Ⅳ-實驗過程中RNA的提取步驟
    附錄Ⅴ-BCA標曲的測定
    對各答辯委員的答復(fù)書



本文編號：3880219