發(fā)布時間：2024-01-17 15:11

　　目的：利用PET原核表達系統(tǒng)和pFastBac/NT-TOPO真核表達系統(tǒng)分別表達出非洲豬瘟病毒蛋白p54，建立檢測非洲豬瘟血清抗體的間接ELISA方法。同時制備p54的單克隆抗體。 方法：將非洲豬瘟病毒蛋白p54的基因克隆到原核表達載體pET-52b(+)3C/LIC上，再轉入大腸桿菌BL21(ED3)中，獲得重組表達蛋白p54。超聲破碎菌體，取離心后上清進行SDS PAGE和Western blot分析。優(yōu)化誘導表達條件，利用表達蛋白上的六組氨酸標簽進行蛋白純化，獲得高純度的p54。將純化后的p54包被酶標板，建立檢測非洲豬瘟血清抗體的間接ELISA方法。 將非洲豬瘟病毒蛋白p54基因克隆到真核載體pFast/NT-TOPO上，轉入大腸桿菌DH5α中，擴大培養(yǎng)后涂布抗生素篩選平板，挑取生長的單克隆菌落獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定正確后，轉入大腸桿菌DH10Bac中，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體介導，獲得重組桿狀病毒。用重組桿狀病毒感染sf9細胞，72h后收集細胞，超聲破碎，取離心后上清進行SDS-PAGE和Western-blot分析。用上清包被酶標板，建立檢測非洲豬瘟血清抗體的...

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫表
目錄
第一章 前言
    1.非洲豬瘟的流行趨勢
    2.非洲豬瘟的病理學特征
        2.1 非洲豬瘟的臨床特征
        2.2 非洲豬瘟常見宿主
        2.3 非洲豬瘟病的傳播途徑
    3. 非洲豬瘟病毒形態(tài)學特征和主要組成蛋白
    4.非洲豬瘟檢測方法
        4.1 病毒分離
        4.2 分子生物學檢測方法
            4.2.1 常規(guī) PCR
            4.2.2 實時定量熒光 PCR
            4.2.3 圓環(huán)介導的等溫擴增
        4.3 免疫學檢測方法
            4.3.1 抗原檢測
            4.3.2 抗體檢測
    5. 本研究的目的及意義
    6. 技術路線
第二章 非洲豬瘟病毒蛋白 p54 的原核表達及間接 ELISA 方法的建立
    1.實驗材料
        1.1 主要實驗試劑和儀器
        1.2 主要溶液配方
    2. 實驗方法
        2.1 p54 原核表達載體構建
            2.1.1 目的基因擴增
            2.1.2 目的基因片段回收
            2.1.3 目的基因與表達載體連接
            2.1.4 原核表達載體的轉化和鑒定
                2.1.4.1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
                2.1.4.2 陽性克隆的篩選及鑒定
        2.2 大腸桿菌的誘導表達及條件優(yōu)化
        2.3 重組表達蛋白的純化及 Western-blot 分析
            2.3.1 重組表達蛋白的純化
            2.3.2 重組表達蛋白的 Western-blot 分析
        2.4 間接 ELISA 方法的建立
            2.4.1 包被濃度和血清稀釋度的確定
            2.4.2 ELISA 最佳反應條件的確定
            2.4.3 重復性評價
            2.4.4 陰陽性判定閾值與檢測限的判定
            2.4.5 符合率、特異性和靈敏性的評價
    3 實驗結果
        3.1 原核表達載體的構建
            3.1.1 目的基因的擴增
            3.1.2 原核表達載體的鑒定
            3.1.3 蛋白表達條件的優(yōu)化
            3.1.4 表達蛋白純化的 SDS PAGE 和 Western blot 分析
        3.2 間接 ELISA 方法的建立
            3.2.1 最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的確定
            3.2.3 最佳反應條件的確定
            3.2.4 重復性評價
            3.2.5 陰陽性判定閾值與檢測限的確定
            3.2.6 符合率、靈敏性和特異性的評價
第三章 非洲豬瘟病毒蛋白 p54 的真核表達及間接 ELISA 方法的建立
    1.實驗材料
        1.1 主要實驗試劑和儀器
        1.2 主要溶液配方
    2. 實驗方法
        2.1 真核表達載體的構建
            2.1.1 目的基因的擴增
            2.1.2 目的基因與載體連接
            2.1.3 重組質(zhì)粒的轉座和鑒定
            2.1.4 bacmid 的脂質(zhì)化
            2.1.5 重組桿狀病毒的獲得
        2.2 重組蛋白的 SDS-PAGE 和 Western-blot 分析
        2.3 間接 ELISA 檢測方法的建立
            2.3.1 最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的確定
            2.3.2 ELISA 最佳反應條件的確定
            2.3.3 重復性評價
            2.3.4 陰陽性判定閾值與檢測限的判定
            2.3.5 符合率、特異性和靈敏性的評價
    3. 實驗結果
        3.1 真核表達載體的構建
            3.1.1 目的基因的擴增
            3.1.2 真核重組載體的鑒定
            3.1.3 重組桿狀病毒鑒定
            3.1.4 重組桿狀病毒的獲得
        3.2 重組蛋白的 SDS-PAGE 和 Western-blot 檢測
        3.3 間接 ELISA 檢測方法的建立
            3.3.1 最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的確定
            3.3.2 最佳反應條件的確定
            3.3.3 重復性評價
            3.3.4 陰陽性判定閾值與檢測限的判定
            3.3.5 符合率、靈敏性和特異性的評價
第四章 非洲豬瘟病毒蛋白 p54 單克隆抗體制備
    1.實驗材料
        1.1 主要實驗試劑和儀器
        1.2 主要溶液配方
    2 實驗方法
        2.1 抗原免疫
        2.2 免疫小鼠的選擇及免疫血清效價的測定
        2.3 骨髓瘤細胞 SP2/0 的培養(yǎng)和飼養(yǎng)細胞的制備
            2.3.1 骨髓瘤細胞 SP2/0 的培養(yǎng)
            2.3.2 飼養(yǎng)細胞制備
        2.4 小鼠脾細胞與 SP2/0 細胞融合
            2.4.1 小鼠脾細胞的獲取
            2.4.2 細胞融合
        2.5 雜交瘤細胞的篩選及克隆
        2.6 細胞建株
        2.7 腹水型單抗制備
    3 實驗結果
        3.1 免疫小鼠的選擇及免疫血清效價的測定
            3.1.1 免疫小鼠的選擇
            3.1.2 免疫血清效價測定
        3.2 雜交瘤細胞的篩選
        3.3 腹水型單抗的制備及純化
第五章 小結與討論
    1. 小結
    2. 討論
參考文獻
在讀期間發(fā)表論文和學術交流情況
致謝



本文編號：3879309