發(fā)布時間：2024-01-14 12:54

　　精子發(fā)生是一個需要多種細胞共同參與的過程,其中支持細胞由于其特異的生理功能,對精子發(fā)生發(fā)揮著重要的作用。大量研究表明,支持細胞的增殖受到miRNA以及其它因子的調節(jié)。課題組前期研究發(fā)現環(huán)指蛋白4(ring finger protein4,RNF4)與雄激素受體(androgen receptor,AR)在豬睪丸細胞(swine testicular cell,ST)內共定位,并可能通過AR影響ST細胞生長。本課題在這個實驗結果的基礎上,以AR基因為主要研究對象,探究AR是否和RNF4存在互作以及AR在ST細胞增殖中的功能,并探究調控AR表達的分子機制。本課題主要研究結果如下:1、RNF4與AR互作的研究通過Co-IP證明AR和RNF4在ST細胞內結合,缺失AR基因DBD(DNA binding domain)結構域后,AR與RNF4的結合消失。2、AR在睪丸組織中的表達以及對ST細胞的影響通過組織切片免疫熒光技術檢測AR在性成熟前后大白豬睪丸中的表達。實驗結果表明在60日齡和180日齡的大白豬睪丸中,AR均有表達。構建AR的超表達載體以及合成AR的干擾片段,通過qRT-PCR和West...

【文章頁數】：67 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文章綜述
    1 研究問題的由來
    2 精子發(fā)生
        2.1 精子發(fā)生過程
        2.2 睪丸支持細胞在精子發(fā)生中的功能
    3 雄激素受體基因研究進展
    4 RNF4基因研究進展
    5 miRNA在精子發(fā)生過程中的研究
        5.1 miRNA在精子發(fā)生過程中的功能研究
        5.2 miR-124a的研究進展
    6 研究目的與意義
第二章 AR調控未成熟豬睪丸支持細胞增殖的分子機制研究
    1 試驗材料
        1.1 細胞系
        1.2 組織
        1.3 菌株、載體和抗體
        1.4 主要儀器和設備
        1.5 主要試劑與試劑盒
        1.6 常用試劑及配制
        1.7 生物信息學網站及分析軟件
        1.8 統(tǒng)計學方法
    2 試驗方法
        2.1 RNF4與AR的互作
            2.1.1 AR含HA標簽載體構建
            2.1.2 細胞的復蘇
            2.1.3 細胞的培養(yǎng)
            2.1.4 細胞的凍存
            2.1.5 細胞的轉染
            2.1.6 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
            2.1.7 Westernblot
        2.2 AR的功能研究
            2.2.0 豬睪丸組織切片免疫熒光
            2.2.1 AR真核表達載體構建及干擾片段合成
            2.2.2 細胞轉染
            2.2.3 細胞總RNA提取
            2.2.4 cDNA的制備
            2.2.5 實時熒光定量PCR檢測AR及相關基因mRNA表達水平
            2.2.6 總蛋白提取
            2.2.7 蛋白濃度的測定
            2.2.8 Westernblot
            2.2.9 流式細胞術分析細胞周期
            2.2.10 Cellcountingkit-8(CCK-8)檢測細胞增殖
        2.3 miR-124a功能研究
            2.3.1 AR的靶miRNA預測
            2.3.2 雙熒光素酶報告載體的構建
            2.3.3 miR-124a模擬物和抑制物的合成
            2.3.4 細胞轉染
            2.3.5 雙熒光素酶活性檢測
            2.3.6 突變型雙熒光素酶報告載體的構建
            2.3.7 細胞總RNA提取
            2.3.8 cDNA制備
            2.3.9 實時熒光定量PCR檢測miR-124a和基因mRNA的表達水平
            2.3.10 細胞總蛋白提取
            2.3.11 蛋白濃度測定
            2.3.12 Westernblot
            2.3.13 流式細胞術分析細胞周期
            2.3.14 CCK8分析細胞增殖
    3 結果
        3.1 RNF4與AR互作關系的鑒定
        3.2 AR對細胞的影響
            3.2.1 AR在豬睪丸組織中的表達
            3.2.2 AR超表達與抑制表達驗證
            3.2.3 AR對細胞周期的影響
            3.2.4 AR對細胞增殖的影響
            3.2.5 缺失AR基因DBD對細胞周期和增殖的影響
        3.3 miR-124a與AR基因3’UTR的驗證
            3.3.1 AR靶miRNA預測
            3.3.2 靶位點驗證
            3.3.3 miR-124a對AR基因表達調控的驗證
        3.4 miR-124a對細胞的影響
            3.4.1 miR-124a對細胞周期的影響
            3.4.2 miR-124a對細胞增殖的影響
    4 討論
        4.1 睪丸支持細胞增殖的研究
        4.2 RNF4與AR的互作
        4.3 miR-124a、AR與未成熟豬睪丸支持細胞增殖
第三章 結語
    1 主要結論
    2 下一步工作
參考文獻
致謝



本文編號：3878268