精子發(fā)生是一個(gè)需要多種細(xì)胞共同參與的過程,其中支持細(xì)胞由于其特異的生理功能,對精子發(fā)生發(fā)揮著重要的作用。大量研究表明,支持細(xì)胞的增殖受到miRNA以及其它因子的調(diào)節(jié)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)環(huán)指蛋白4(ring finger protein4,RNF4)與雄激素受體(androgen receptor,AR)在豬睪丸細(xì)胞(swine testicular cell,ST)內(nèi)共定位,并可能通過AR影響ST細(xì)胞生長。本課題在這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以AR基因?yàn)橹饕芯繉ο?探究AR是否和RNF4存在互作以及AR在ST細(xì)胞增殖中的功能,并探究調(diào)控AR表達(dá)的分子機(jī)制。本課題主要研究結(jié)果如下:1、RNF4與AR互作的研究通過Co-IP證明AR和RNF4在ST細(xì)胞內(nèi)結(jié)合,缺失AR基因DBD(DNA binding domain)結(jié)構(gòu)域后,AR與RNF4的結(jié)合消失。2、AR在睪丸組織中的表達(dá)以及對ST細(xì)胞的影響通過組織切片免疫熒光技術(shù)檢測AR在性成熟前后大白豬睪丸中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在60日齡和180日齡的大白豬睪丸中,AR均有表達(dá)。構(gòu)建AR的超表達(dá)載體以及合成AR的干擾片段,通過qRT-PCR和West...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文章綜述
    1 研究問題的由來
    2 精子發(fā)生
        2.1 精子發(fā)生過程
        2.2 睪丸支持細(xì)胞在精子發(fā)生中的功能
    3 雄激素受體基因研究進(jìn)展
    4 RNF4基因研究進(jìn)展
    5 miRNA在精子發(fā)生過程中的研究
        5.1 miRNA在精子發(fā)生過程中的功能研究
        5.2 miR-124a的研究進(jìn)展
    6 研究目的與意義
第二章 AR調(diào)控未成熟豬睪丸支持細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞系
        1.2 組織
        1.3 菌株、載體和抗體
        1.4 主要儀器和設(shè)備
        1.5 主要試劑與試劑盒
        1.6 常用試劑及配制
        1.7 生物信息學(xué)網(wǎng)站及分析軟件
        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 RNF4與AR的互作
            2.1.1 AR含HA標(biāo)簽載體構(gòu)建
            2.1.2 細(xì)胞的復(fù)蘇
            2.1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)
            2.1.4 細(xì)胞的凍存
            2.1.5 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
            2.1.6 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
            2.1.7 Westernblot
        2.2 AR的功能研究
            2.2.0 豬睪丸組織切片免疫熒光
            2.2.1 AR真核表達(dá)載體構(gòu)建及干擾片段合成
            2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.2.3 細(xì)胞總RNA提取
            2.2.4 cDNA的制備
            2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測AR及相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平
            2.2.6 總蛋白提取
            2.2.7 蛋白濃度的測定
            2.2.8 Westernblot
            2.2.9 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期
            2.2.10 Cellcountingkit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞增殖
        2.3 miR-124a功能研究
            2.3.1 AR的靶miRNA預(yù)測
            2.3.2 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建
            2.3.3 miR-124a模擬物和抑制物的合成
            2.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.3.5 雙熒光素酶活性檢測
            2.3.6 突變型雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建
            2.3.7 細(xì)胞總RNA提取
            2.3.8 cDNA制備
            2.3.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-124a和基因mRNA的表達(dá)水平
            2.3.10 細(xì)胞總蛋白提取
            2.3.11 蛋白濃度測定
            2.3.12 Westernblot
            2.3.13 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期
            2.3.14 CCK8分析細(xì)胞增殖
    3 結(jié)果
        3.1 RNF4與AR互作關(guān)系的鑒定
        3.2 AR對細(xì)胞的影響
            3.2.1 AR在豬睪丸組織中的表達(dá)
            3.2.2 AR超表達(dá)與抑制表達(dá)驗(yàn)證
            3.2.3 AR對細(xì)胞周期的影響
            3.2.4 AR對細(xì)胞增殖的影響
            3.2.5 缺失AR基因DBD對細(xì)胞周期和增殖的影響
        3.3 miR-124a與AR基因3’UTR的驗(yàn)證
            3.3.1 AR靶miRNA預(yù)測
            3.3.2 靶位點(diǎn)驗(yàn)證
            3.3.3 miR-124a對AR基因表達(dá)調(diào)控的驗(yàn)證
        3.4 miR-124a對細(xì)胞的影響
            3.4.1 miR-124a對細(xì)胞周期的影響
            3.4.2 miR-124a對細(xì)胞增殖的影響
    4 討論
        4.1 睪丸支持細(xì)胞增殖的研究
        4.2 RNF4與AR的互作
        4.3 miR-124a、AR與未成熟豬睪丸支持細(xì)胞增殖
第三章 結(jié)語
    1 主要結(jié)論
    2 下一步工作
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3878268