產(chǎn)奶性狀是奶牛最為重要的經(jīng)濟(jì)性狀,篩選和挖掘影響奶牛產(chǎn)奶性狀的功能基因或致因突變是奶牛分子育種研究中的研究熱點(diǎn)。本課題組基于前期全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果篩選出GPIHBP1基因作為產(chǎn)奶性狀重要的候選功能基因。為了探究GPIHBP1基因在產(chǎn)奶性狀上的生理功能以及作用機(jī)制,本研究在牛原代乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行了GPIHBP1基因功能驗(yàn)證研究。同時(shí)為進(jìn)一步全面挖掘影響奶牛產(chǎn)奶性狀的候選基因,本研究采取RNA-seq技術(shù)對奶牛不同泌乳時(shí)期的基因轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行研究,篩選調(diào)控奶牛泌乳過程的差異表達(dá)基因,為后續(xù)開展基因功能驗(yàn)證提供依據(jù)。 本研究通過在奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行GPIHBP1表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染研究以及RNA干擾試驗(yàn),并使用熒光定量PCR試驗(yàn)檢測了乳脂乳蛋白合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化,對其進(jìn)行功能分析。研究發(fā)現(xiàn)在牛原代乳腺上皮細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GPIHBP1表達(dá)載體之后,4種酪蛋白基因(CSN1S1、CSN1S2、CSN2以及CSN3)以及乳鐵蛋白基因(LTF)的表達(dá)水平均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢,而p乳球蛋白基因(LGB)的表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。脂蛋白脂肪酶基因(LPL)、CD36基因、極低密度脂蛋白受體基因(...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 QTL研究概述
    1.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析
        1.2.1 GWAS在畜禽中的應(yīng)用
        1.2.2 GWAS中存在的問題
    1.3 GPIHBP1基因研究進(jìn)展概述
        1.3.1 GPIHBP1基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.3.2 GPIHBP1基因敲除小鼠
        1.3.3 GPIHBP1基因突變與人的乳糜微粒血癥
        1.3.4 GPIHBP1基因的表達(dá)和調(diào)控
        1.3.5 GPIHBP1參與LPL的轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.3.6 牛GPIHBP1基因研究現(xiàn)狀
    1.4 RNA測序
        1.4.1 RNA-seq平臺
        1.4.2 RNA-seq原理
        1.4.3 RNA-Seq技術(shù)優(yōu)勢
        1.4.4 RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用
        1.4.5 RNA-Seq的發(fā)展前景以及面臨的挑戰(zhàn)
    1.5 研究目的和意義
第二章 GPIHBP1基因細(xì)胞功能驗(yàn)證
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)樣品
        2.1.2 主要試劑和溶液配置
        2.1.3 主要試驗(yàn)儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 組織以及細(xì)胞RNA提取
        2.2.2 反轉(zhuǎn)錄
        2.2.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
        2.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
        2.2.5 Taq-man探針法定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
        2.2.6 GPIHBP1表達(dá)載體構(gòu)建
        2.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.8 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代牛乳腺上皮細(xì)胞
        2.2.9 siRNA設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染
        2.2.10 統(tǒng)計(jì)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 組織RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄結(jié)果
        2.3.2 組織特異性表達(dá)分析
        2.3.3 牛GPIHBP1基因序列分析
        2.3.4 牛GPIHBP1可變剪切體分析
        2.3.5 GPIHBP1可變剪切體定量分析
        2.3.6 GPIHBP1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.7 GPIHBP1基因表達(dá)載體的牛乳腺上皮轉(zhuǎn)染
        2.3.8 GPIHBP1基因過表達(dá)細(xì)胞定量PCR檢測
        2.3.9 GPIHBP1基因siRNA預(yù)實(shí)驗(yàn)
        2.3.10 GPIHBP1基因siRNA細(xì)胞定量PCR檢測
    2.4 討論與小結(jié)
        2.4.1 牛GPIHBP1基因可變剪切體
        2.4.2 牛GPIHBP1基因組織特異性表達(dá)分析
        2.4.3 牛GPIHBP1基因?qū)θ榈鞍兹橹嚓P(guān)基因的調(diào)控作用
第三章 牛GPIHIBP1啟動子活性分析
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 試驗(yàn)樣品
        3.1.2 主要試劑和溶液配置
        3.1.3 主要試驗(yàn)儀器
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 基因組DNA的提取
        3.2.2 GPIHBP1基因啟動子區(qū)序列分析
        3.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
        3.2.5 啟動子重組質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.6 質(zhì)粒提取
        3.2.7 293T細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.8 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.9 雙熒光素酶檢測試驗(yàn)
        3.2.10 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測
        3.2.11 凝膠阻滯試驗(yàn)(EMSA)
        3.2.12 統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 基因組DNA的提取結(jié)果
        3.3.2 GPIHBP1啟動子區(qū)序列分析
        3.3.3 啟動子重組載體構(gòu)建
        3.3.4 GPIHBP1啟動子活性測定
        3.3.5 GPIHBP1啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測
        3.3.6 凝膠阻滯結(jié)果
        3.3.7 GPIHBP1啟動子區(qū)單倍型關(guān)聯(lián)分析
        3.3.8 GPIHBP1分型表達(dá)結(jié)果
    3.4 討論
        3.4.1 GPIHBP1啟動子活性分析與分型定量表達(dá)分析
        3.4.2 啟動子活性分析及凝膠阻滯試驗(yàn)
        3.4.3 育種值關(guān)聯(lián)分析
第四章 中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀轉(zhuǎn)錄組分析
    4.1 試驗(yàn)材料
        4.1.1 資源群體的構(gòu)建
        4.1.2 主要試劑和溶液配置
        4.1.3 主要試驗(yàn)儀器
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 血樣采集
        4.2.2 奶樣采集
        4.2.3 RNA提取與質(zhì)量控制
        4.2.4 cDNA文庫制備與測序
        4.2.5 cDNA文庫轉(zhuǎn)錄組測序
        4.2.6 轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)控
        4.2.7 測序reads比對
        4.2.8 未注釋基因和轉(zhuǎn)錄本的檢測
        4.2.9 差異表達(dá)基因、差異性剪切和差異性啟動子使用的檢測
        4.2.10 差異表達(dá)基因與Animal QTL數(shù)據(jù)庫比對分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 RNA提取結(jié)果
        4.3.2 RNA測序質(zhì)量
        4.3.3 Reads比對結(jié)果
        4.3.4 差異表達(dá)基因篩選
        4.3.5 時(shí)期特異性差異表達(dá)基因
        4.3.6 差異表達(dá)基因與QTL信息比對
        4.3.7 Pathway分析和GO分析
        4.3.8 差異剪切分析
        4.3.9 Promoters差異分析
    4.4 討論
        4.4.1 牛奶RNA來源
        4.4.2 牛血差異基因分析
        4.4.3 牛奶差異基因分析
        4.4.4 較少差異表達(dá)基因位于QTL數(shù)據(jù)庫內(nèi)的原因
        4.4.5 GO分析和pathway分析
        4.4.6 可變剪切體分析
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡歷
附錄



本文編號：3866796