豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus, PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一。PPV感染呈世界性分布，在許多地方已經(jīng)成為地方性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PPV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，為單股負(fù)鏈DNA病毒，無囊膜，衣殼蛋白包括VP1、VP2和VP3，其中VP2為主要的結(jié)構(gòu)蛋白。VP2決定著PPV的組織嗜性、毒力和血凝活性，并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。VP2在桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（BEVS）中能夠自我組裝成病毒樣顆粒（VLPs），是亞單位疫苗研究的首選蛋白。為評(píng)價(jià)VP2作為亞單位疫苗的潛力，本研究分別利用BEVS和pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2，比較其反應(yīng)原性和免疫原性的差異。 應(yīng)用電子顯微鏡觀察兩種VP2的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)BEVS表達(dá)的VP2能夠自我組裝成VLPs，而pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP2不能組裝成VLPs。western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩種VP2均能夠與PPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。血凝試驗(yàn)（HA）發(fā)現(xiàn)BEVS表達(dá)的VP2具有血凝活性，血凝效價(jià)為210，而pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP2無血凝活性。將兩種VP2作為免疫試劑分別免疫豚鼠，將豚鼠隨機(jī)分Ⅰ組（滅活疫苗1....

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 PPV 研究進(jìn)展
        1.1.1 PPV 簡介
        1.1.2 PPV 感染的臨床癥狀
        1.1.3 PPV 的分子生物學(xué)特性
        1.1.4 PPV 的培養(yǎng)特性
        1.1.5 PPV 感染機(jī)制
        1.1.6 PPV 感染的組織病變
        1.1.7 PPV 的流行病學(xué)
    1.2 VP2 基因及其編碼的蛋白研究進(jìn)展
    1.3 PPV 疫苗研究進(jìn)展
        1.3.1 弱毒疫苗
        1.3.2 滅活疫苗
        1.3.3 基因疫苗
    1.4 研究的目的及意義
第二章 VP2 在桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中的表達(dá)
    2.1 試驗(yàn)材料與器材
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試驗(yàn)器材
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 重組桿狀病毒在 Sf9 細(xì)胞中的培養(yǎng)
        2.2.2 VP2 電鏡觀察
        2.2.3 VP2 Western blot 試驗(yàn)
        2.2.4 VP2 血凝試驗(yàn)
        2.2.5 VP2 純化
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 VP2 電鏡觀察結(jié)果
        2.3.2 VP2 Western blot 試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.3 VP2 血凝試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.4 VP2 純化結(jié)果
    2.4 討論
第三章 VP2 在 pET 表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)
    3.1 試驗(yàn)材料與器材
        3.1.1 試驗(yàn)材料
        3.1.2 主要試驗(yàn)器材
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 PPV 基因組 DNA 的提取
        3.2.3 VP2 基因全長序列的擴(kuò)增
        3.2.4 PCR 產(chǎn)物的純化
        3.2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.6 重組質(zhì)粒的提取
        3.2.7 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.8 重組質(zhì)粒的表達(dá)
        3.2.9 VP2 電鏡觀察
        3.2.10 VP2 Western blot 試驗(yàn)
        3.2.11 VP2 血凝試驗(yàn)
        3.2.12 VP2 純化
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 VP2 基因全長序列的擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
        3.3.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)結(jié)果
        3.3.4 VP2 電鏡觀察結(jié)果
        3.3.5 VP2 Western blot 試驗(yàn)結(jié)果
        3.3.6 VP2 血凝試驗(yàn)結(jié)果
        3.3.7 VP2 純化結(jié)果
    3.4 討論
第四章 納米 PCR 檢測方法的建立
    4.1 試驗(yàn)材料
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 引物設(shè)計(jì)
        4.2.2 VP2 重組質(zhì)粒模板的制備
        4.2.3 納米 PCR 檢測方法的建立以及條件優(yōu)化
        4.2.4 敏感性試驗(yàn)
        4.2.5 特異性試驗(yàn)
        4.2.6 納米 PCR 與普通 PCR 對臨床樣品的檢測比較
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 陽性模板的制備
        4.3.2 納米 PCR 檢測方法的建立以及條件優(yōu)化
        4.3.3 敏感性試驗(yàn)
        4.3.4 特異性試驗(yàn)
        4.3.5 臨床樣品的檢測
    4.4 討論
第五章 VP2 亞單位疫苗免疫豚鼠試驗(yàn)
    5.1 試驗(yàn)材料
    5.2 試驗(yàn)方法
        5.2.1 豚鼠試驗(yàn)免疫方案
        5.2.2 血凝抑制試驗(yàn)
        5.2.3 病毒 TCID50的測定
        5.2.4 攻毒以及保護(hù)效力的評(píng)價(jià)
        5.2.5 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
        5.2.6 納米 PCR 檢測
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果
        5.3.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果
        5.3.3 納米 PCR 檢測結(jié)果
    5.4 討論
        5.4.1 血凝抑制試驗(yàn)
        5.4.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
        5.4.3 納米 PCR 檢測
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號(hào)：3865633