規(guī)�；i群養(yǎng)殖密度的增大使得豬群之間接觸頻率增加,間接加快了疾病的傳播速度。我國豬疫病混合感染的比例大幅度上升,繁殖障礙類疾病也多呈現(xiàn)混合感染。當(dāng)前以豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)以及豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(Porcine circovirusⅡ,PCV-2)引起的豬繁殖障礙類疾病為主要危害。因五種繁殖障礙性疾病具有相似的臨床癥狀,增加了臨床快速鑒別診斷的難度。目前,實(shí)驗(yàn)室常用的血清學(xué)診斷及病毒分離鑒定等方法存在著費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性低的缺陷,不能滿足臨床診斷的需求。基因芯片技術(shù)是集分子生物學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)及熒光標(biāo)記技術(shù)于一體的新的基因檢測方法,該方法具有快速、高特異性、高靈敏性、高通量、多樣性等特點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物篩選、多態(tài)性分析等多個(gè)領(lǐng)域。多重PCR可靈...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 豬五種繁殖障礙性病毒病及其診斷技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.1 概述
            1.1.1 豬瘟的概述
            1.1.2 豬細(xì)小病毒的概述
            1.1.3 豬呼吸與繁殖綜合征概述
            1.1.4 日本乙型腦炎概述
            1.1.5 豬圓環(huán)病毒2型概述
        1.2 五種病毒診斷技術(shù)的研究進(jìn)展
            1.2.1 病毒的分離與鑒定
            1.2.2 血清學(xué)檢測
                1.2.2.1 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)
                1.2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)
                1.2.2.3 免疫過氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)(IPMA)
                1.2.2.4 病毒中和試驗(yàn)(SN)
            1.2.3 分子生物學(xué)技術(shù)
                1.2.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
                1.2.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)
                1.2.3.3 原位雜交技術(shù)(ISH)
                1.2.3.4 基因芯片技術(shù)
    2 基因芯片技術(shù)及其在豬重大病毒性疾病研究中的應(yīng)用
        2.1 基因芯片概述
            2.1.1 基因芯片技術(shù)的概念
            2.1.2 基因芯片技術(shù)的原理
            2.1.3 基因芯片的分類及常用技術(shù)比較
        2.2 基因芯片技術(shù)的操作流程
            2.2.1 基因芯片探針的設(shè)計(jì)及芯片方陣的構(gòu)建
            2.2.2 基因芯片載體的選擇
            2.2.3 基因芯片的制備方法
            2.2.4 樣品的制備與標(biāo)記
            2.2.5 芯片雜交與雜交后清洗
            2.2.6 信號檢測與結(jié)果分析
        2.3 基因芯片技術(shù)在豬重大病毒性疾病研究中的應(yīng)用
            2.3.1 基因芯片在病毒性疾病診斷中的應(yīng)用
            2.3.2 利用基因芯片技術(shù)對病毒進(jìn)行基因分型
            2.3.3 基因芯片在感染性疾病致病機(jī)制中的應(yīng)用
            2.3.4 基因芯片在基因表達(dá)分析中的應(yīng)用
        2.4 基因芯片技術(shù)存在的問題以及對未來的展望
    3 本研究的目的與意義
第二章 試驗(yàn)研究
    試驗(yàn)一CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2五種豬繁殖障礙性病毒病多重PCR診斷方法的建立
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 材料
                2.1.1 毒株及病料來源
                2.1.2 主要試劑
                2.1.3 主要儀器
            2.2 方法
                2.2.1 病毒基因組DNA的提取及檢測
                    2.2.1.1 基因組DNA的提取
                2.2.2 RNA的提取、檢測及反轉(zhuǎn)錄
                    2.2.2.1 RNA的提取
                    2.2.2.2 RNA的檢測
                    2.2.2.3 RNA的反轉(zhuǎn)錄
                2.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成
                2.2.4 五種病毒單項(xiàng)PCR反應(yīng)體系的建立
                2.2.5 多重PCR反應(yīng)體系的建立
                2.2.6 敏感性試驗(yàn)
                2.2.7 特異性試驗(yàn)
                2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)
                2.2.9 臨床樣品檢測
        3 結(jié)果與分析
            3.1 基因組DNA、RNA的檢測結(jié)果
            3.2 基因同源性分析及引物設(shè)計(jì)
            3.3 五種病毒單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果
            3.4 多重PCR擴(kuò)增結(jié)果
            3.5 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果
            3.6 敏感性試驗(yàn)
            3.7 特異性試驗(yàn)
            3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)
            3.9 臨床樣品檢測
        4 結(jié)論與討論
            4.1 關(guān)于RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
            4.2 引物的設(shè)計(jì)
            4.3 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
    試驗(yàn)二CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2豬五種繁殖障礙性病毒病聯(lián)合檢測基因芯片診斷方法的建立
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 材料
                2.1.1 毒株來源及病料來源
                2.1.2 主要試劑
                2.1.3 芯片材料
                2.1.4 主要儀器
            2.2 方法
                2.2.1 基因組DNA、RNA的提取
                2.2.2 引物與探針的設(shè)計(jì)
                2.2.3 引物與探針的合成
                2.2.4 多重PCR制備雜交用PCR產(chǎn)物
                2.2.5 基因芯片的制備
                    2.2.5.1 芯片陣列的設(shè)計(jì)
                    2.2.5.2 芯片的點(diǎn)樣及處理
                    2.2.5.3 基因芯片的雜交
                    2.2.5.4 基因芯片的洗滌與干燥
                    2.2.5.5 基因芯片掃描及掃描結(jié)果的分析
                2.2.6 基因芯片制備過程的優(yōu)化
                    2.2.6.1 寡核苷酸探針合成時(shí)間隔臂Poly(dT)有無的選擇
                    2.2.6.2 點(diǎn)樣及雜交濕度的優(yōu)化
                    2.2.6.3 探針濃度的選擇
                    2.2.6.4 雜交溫度的優(yōu)化
                    2.2.6.5 雜交時(shí)間的選擇
                2.2.7 基因芯片的特異性試驗(yàn)
                2.2.8 基因芯片的重復(fù)性試驗(yàn)
                2.2.9 基因芯片的靈敏性試驗(yàn)
                2.2.10 臨床樣品檢測
        3 結(jié)果與分析
            3.1 雜交用PCR產(chǎn)物的制備
            3.2 寡核苷酸探針合成時(shí)間隔臂Poly(dT)有無的選擇結(jié)果
            3.3 點(diǎn)樣及雜交濕度的優(yōu)化結(jié)果
            3.4 探針濃度的選擇結(jié)果
            3.5 雜交溫度的優(yōu)化結(jié)果
            3.6 雜交時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果
            3.7 基因芯片的特異性試驗(yàn)
            3.8 基因芯片的靈敏性試驗(yàn)
            3.9 基因芯片的重復(fù)性試驗(yàn)
            3.10 臨床樣品檢測
        4 結(jié)論與討論
            4.1 熒光標(biāo)記的選擇和探針的修飾
            4.2 基因芯片點(diǎn)樣過程的優(yōu)化
            4.3 雜交條件的選擇
            4.4 聯(lián)合檢測基因芯片的特異性、靈敏性試驗(yàn)
            4.5 臨床樣品檢測
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
英文摘要
發(fā)表論文及專利



本文編號：3863454