發(fā)布時間：2023-11-11 13:02

　　為了在體外獲得表達(dá)量高、儲存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亞型HA蛋白,利用水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HA蛋白。首先,將HA基因根據(jù)水稻偏好密碼子進(jìn)行優(yōu)化,合成到pUC57載體上,通過雙酶切、連接將HA基因先后構(gòu)建到中間載體pMP3和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300上;再通過電極法將pCAMBIA1300-HA導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105中;然后用農(nóng)桿菌侵染TP309水稻愈傷組織;最后經(jīng)潮霉素篩選、分化、生根、移栽至田間種植。利用CTAB法提取葉片基因組DNA,PCR鑒定T₀陽性植株;利用Dot Blot和Western Blot檢測HA蛋白在水稻胚乳中的表達(dá);提取陽性的T₁葉片DNA,通過熒光定量PCR方法篩選純合植株;利用溫湯殺雄剪穎授粉法,將含有HA蛋白的TP309與低谷蛋白水稻雜交;利用Western Blot檢測雜交后的T₃植株蛋白表達(dá)量;利用雙抗夾心ELISA方法比較水稻源和昆蟲表達(dá)HA蛋白的活性。結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了中間載體pMP3-HA和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-...

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 試驗材料
    1.2 試驗方法
        1.2.1 HA基因序列優(yōu)化及引物設(shè)計
        1.2.2 中間載體和植物表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.3 HA基因的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        1.2.4 轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測
        1.2.5 T1水稻種子HA蛋白的表達(dá)鑒定
        1.2.6 純合子植株的篩選
        1.2.7 高表達(dá)雜交植株的篩選
        1.2.8 HA蛋白活性檢測
2 結(jié)果與分析
    2.1 重組質(zhì)粒的鑒定與分析
    2.2 HA陽性植株的篩選與分析
    2.3 HA蛋白表達(dá)鑒定與分析
    2.4 T1HA純合子植株的篩選與分析
    2.5 高表達(dá)雜交植株的鑒定與分析
    2.6 HA蛋白ELISA檢測分析
3 結(jié)論與討論



本文編號：3862595