口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一種具有高度傳染性的疾病,它發(fā)病急,傳播快,易感動(dòng)物種類多,主要侵害豬、牛、羊等經(jīng)濟(jì)價(jià)值大的牲畜和野生偶蹄獸,該病在世界流行廣泛,造成的影響也極為嚴(yán)重�？谔阋咭砸呙缑庖叻揽貫橹�,但臨床存在的自然感染和疫苗免疫現(xiàn)象,對(duì)該病的診斷帶來(lái)了極大的困難。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室推薦使用的診斷方法在臨床中條件受限,不易操作,而膠體金免疫層析技術(shù)日益發(fā)展成熟,在獸醫(yī)臨床檢測(cè)應(yīng)用廣泛,它具有操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短、結(jié)果直觀可靠、較高的靈敏性和特異性等優(yōu)點(diǎn),更適用于口蹄疫的臨床檢測(cè)。本試驗(yàn)利用DNAstar基因分析軟件分析、篩選、預(yù)測(cè)出口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC中抗原性強(qiáng),疏水性好、表面可及性優(yōu)良、柔韌性強(qiáng)的2段氨基酸,將其對(duì)應(yīng)的基因序列片段3ABCa和3ABCb,這2段基因之間用GSLinker序列連接,參考克隆載體的酶切位點(diǎn)并選定EcoRI和XhoI為酶切位點(diǎn),將融合好的基因序列送與合成得到重組克隆載體pET28a-3ABCab。重組克隆載體存在于大腸桿菌DH-5α中,通過(guò)恒溫振蕩培養(yǎng)的方式對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)...

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞表
1 引言
    1.1 口蹄疫概述
    1.2 FMDV基本結(jié)構(gòu)
    1.3 口蹄疫診斷技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.1 病原學(xué)診斷
        1.3.2 血清學(xué)診斷
        1.3.3 間接夾心ELISA
        1.3.4 抗體檢測(cè)
        1.3.5 RT-PCR技術(shù)
        1.3.6 新診斷技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.7 區(qū)分自然感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物及理論依據(jù)
    1.4 免疫膠體金技術(shù)及應(yīng)用
        1.4.1 免疫膠體金技術(shù)基本原理
        1.4.2 免疫膠體金快速診斷技術(shù)
    1.5 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 臨床樣品血清及載體
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑及材料
        2.1.4 溶液及培養(yǎng)基的配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 FMDV融合基因的合成及pET-28a(+)通用引物的合成
        2.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 重組表達(dá)載體的表達(dá)及蛋白的純化
        2.2.4 純化蛋白的Westernblot鑒定
        2.2.5 膠體金免疫層析方法的建立
3 結(jié)果
    3.1 FMDV3ABCab蛋白DNAstar分析及抗原蛋白和基因篩選結(jié)果
    3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.1 pET28a-3ABCab質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.2.2 pET-28a(+)空載雙酶切鑒定
        3.2.3 pET28a-3ABCab特異性引物PCR擴(kuò)增鑒定
        3.2.4 pET28a-3ABCab基因菌液PCR鑒定
        3.2.5 pET28a-3ABCab質(zhì)粒的酶切鑒定
    3.3 融合蛋白的表達(dá)及純化
        3.3.1 pET28a-3ABCab陽(yáng)性菌在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)產(chǎn)物及蛋白可溶性的SDS-PAGE鑒定
        3.3.2 純化蛋白的SDS-PAGE鑒定結(jié)果
        3.3.3 純化蛋白的濃度測(cè)定結(jié)果
        3.3.4 純化蛋白的Westernblot鑒定
    3.4 膠體金免疫層析方法的建立
        3.4.1 膠體金最適pH值的確定
        3.4.2 膠體金最適SPA標(biāo)記量的確定
        3.4.3 最佳噴金量的確定
        3.4.4 T線劃線蛋白3ABCab濃度的篩選確定
        3.4.5 檢測(cè)卡有效性的檢驗(yàn)
        3.4.6 檢測(cè)卡交叉性的檢驗(yàn)
        3.4.7 田間試驗(yàn)
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A
附錄B
附錄C
作者簡(jiǎn)歷
致謝
詳細(xì)摘要



本文編號(hào)：3862565