如何水解自然界中最豐富的碳水化合物——纖維素是一個(gè)重要課題,纖維素的水解依賴于內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC3.2.1.74)、纖維二糖水解酶(EC3.2.1.176)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)的協(xié)同作用。其中β-葡萄糖苷酶將纖維二糖或寡糖水解為非還原末端的葡萄糖,可有效減輕纖維素酶水解過程中纖維二糖對(duì)纖維素酶活性的抑制,提高纖維素降解效果。課題組前期從反芻動(dòng)物綿羊瘤胃中分離篩選到一株可降解纖維素的糞腸球菌CTB(Enterococcus faecalis CTB),并且檢測(cè)到該菌株具有β-葡萄糖苷酶活性。為了探究糞腸球菌為何會(huì)有β-葡萄糖苷酶活性,該酶有何特點(diǎn)或特殊性,對(duì)該菌株進(jìn)行了基因組完成圖測(cè)序,結(jié)果表明具有多條β-葡萄糖苷酶基因,從中選取兩條代表性基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以E.coli BL21(DE3)為宿主對(duì)蛋白進(jìn)行表達(dá),表達(dá)的蛋白分別命名為bgl1213和bgl2557。bgl1213顯示出β-葡萄糖苷酶活性,bgl2557展現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性。CTB-2557表達(dá)的最優(yōu)條件為:最適溫度30℃,最適培養(yǎng)時(shí)間12 h,IPTG濃度1.2...

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 引言
    1.2 β-葡萄糖苷酶簡(jiǎn)介
    1.3 β-葡萄糖苷酶分類
        1.3.1 根據(jù)底物特異性對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分類
        1.3.2 根據(jù)核苷酸序列同一性(NSI)對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分類
    1.4 β-葡萄糖苷酶活性及作用底物
    1.5 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物
        1.5.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的細(xì)菌
        1.5.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的真菌
    1.6 β-葡萄糖苷酶的克隆及異源表達(dá)
    1.7 β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用
        1.7.1 β-葡萄糖苷酶在生物乙醇生產(chǎn)中的重要作用
        1.7.2 β-葡萄糖苷酶在食品中的重要作用
        1.7.3 β-葡萄糖苷酶在醫(yī)藥中的作用
    1.8 課題的研究意義及內(nèi)容
        1.8.1 課題的研究意義
        1.8.2 技術(shù)路線圖
第二章 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的克隆
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 菌株培養(yǎng)
        2.2.2 Enterococcus faecalis CTB基因組提取
        2.2.3 引物設(shè)計(jì)
        2.2.4 PCR擴(kuò)增β-葡萄糖苷酶基因片段
        2.2.5 克隆載體的構(gòu)建
        2.2.6 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的克隆及回收
        2.3.2 陽性克隆菌株的鑒定
        2.3.3 序列測(cè)定及分析
    2.4 小結(jié)
第三章 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 培養(yǎng)基
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.3 酶活測(cè)定
        3.2.4 誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響
        3.2.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響
        3.2.6 IPTG濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 重組子的篩選及鑒定
        3.3.2 重組菌株在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
    3.4 小結(jié)
第四章 重組β-葡萄糖苷酶的純化及性質(zhì)研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株、培養(yǎng)基
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 粗酶液的制備
        4.2.2 純化重組β-葡萄糖苷酶
        4.2.3 SDS-PAGE凝膠檢測(cè)
        4.2.4 濃縮重組β-葡萄糖苷酶
        4.2.5 bgl1213 的酶學(xué)性質(zhì)研究
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 bgl1213 的純化結(jié)果
        4.3.2 bgl1213 酶學(xué)性質(zhì)分析
    4.4 小結(jié)
第五章 重組β-半乳糖苷酶的純化及性質(zhì)研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 粗酶液的制備
        5.2.2 純化重組β-半乳糖苷酶
        5.2.3 SDS-PAGE凝膠檢測(cè)
        5.2.4 濃縮重組β-半乳糖苷酶
        5.2.5 bgl2557 的酶學(xué)性質(zhì)研究
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 bgl2557 的純化結(jié)果
        5.3.2 bgl2557 的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果
    5.4 小結(jié)
總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3860248