新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的具有高度傳染性的家禽傳染病，給世界各國的養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著NDV疫苗的廣泛應(yīng)用，ND的流行雖得到控制，但是其流行趨勢卻在發(fā)生變化，如非典型性ND、病毒新基因型出現(xiàn)和致病性宿主范圍擴(kuò)大等給臨床ND的防控來帶很大困難。HN蛋白是位于NDV囊膜表面的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白、病毒保護(hù)性抗原之一，它在抗原性的決定等方面具有重要作用。本研究在分析河南部分地區(qū)NDV分子流行病學(xué)的基礎(chǔ)上，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了新鄉(xiāng)地區(qū)致病株ND xx08株HN主要抗原區(qū)重組蛋白，利用純化的重組HN蛋白建立檢測ND抗體的間接ELISA方法。 通過雞胚接種病毒收獲尿囊液，血凝（HA）及血凝抑制（HI）試驗檢測其血凝活性，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增NDV F蛋白裂解位點處重要功能區(qū)基因片段，同時進(jìn)行序列測定，構(gòu)建NDV遺傳進(jìn)化樹，分析其遺傳關(guān)系。結(jié)果顯示從發(fā)病死亡雞體內(nèi)分離到6株具有血凝活性的NDV，遺傳進(jìn)化分析表明：6株NDV分離株均屬ClassⅡ、基因Ⅶ型，F(xiàn)蛋白裂解位點處氨基酸序列為...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
縮略詞表
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 NDV 的分子流行病學(xué)研究進(jìn)展
        1.1 ND 的流行情況
        1.2 我國 NDV 分子流行病學(xué)情況
    2 NDV 分子生物學(xué)特性
        2.1 NDV 的形態(tài)結(jié)構(gòu)
        2.2 NDV 的理化特性
        2.3 NDV 的基因組結(jié)構(gòu)特征
        2.4 NDV 編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白
    3 NDV 檢測方法研究進(jìn)展
        3.1 血凝試驗和血凝抑制試驗
        3.2 RT-PCR 技術(shù)
        3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）
        3.4 血清中和實驗（VN）
        3.5 免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique，ICGT）
    4 ND 的防控
第二章 河南省部分地區(qū)雞源 NDV 分子流行病學(xué)特點
    1 試驗材料
        1.1 病料
        1.2 SPF 雞胚及紅細(xì)胞制備
        1.3 酶及相關(guān)試劑
        1.4 試驗儀器
    2 試驗方法
        2.1 病毒分離
        2.2 病毒的血清學(xué)鑒定
        2.3 病毒 RNA 提取
        2.4 病毒 F 基因擴(kuò)增
    3 結(jié)果
        3.1 血清學(xué)鑒定結(jié)果
        3.2 RT-PCR 檢測結(jié)果
        3.3 分離株 F 基因遺傳進(jìn)化分析
        3.4 分離株 F 基因及氨基酸序列分析
    4 討論
        4.1 目前河南部分地區(qū) NDV 毒株流行情況
        4.2 現(xiàn)行疫苗對流行毒株的保護(hù)
        4.3 NDV 分子流行病學(xué)監(jiān)測的重要要性
    5 小結(jié)
第三章 ND xx08 株 HN 基因主要抗原區(qū)的原核表達(dá)及鑒定
    1 試驗材料
        1.1 病毒、菌種和質(zhì)粒
        1.2 酶及其他相關(guān)試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 主要試劑配制
        1.5 SDS-PAGE 電泳緩沖液
        1.6 Western-blott 所用溶液
        1.7 蛋白純化相關(guān)溶液
    2 方法
        2.1 引物設(shè)計與合成
        2.2 病毒基因組 RNA 的提取
        2.3 HN 主要抗原區(qū)基因片段的 PCR 擴(kuò)增
        2.4 PCR 產(chǎn)物的回收與純化
        2.5 NDV xx08 株 HN 基因片段與 pMD18-T-vector 克隆載體連接
        2.6 HN 基因片段連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.7 重組克隆質(zhì)粒的鑒定
        2.8 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-rHN
        2.9 重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)
    3 結(jié)果與分析
        3.1 NDV xx08 株 HN 抗原區(qū)基因片段的獲得
        3.2 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        3.3 NDV HN 抗原區(qū)基因片段的序列分析結(jié)果
        3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.5 表達(dá)產(chǎn)物的分析及鑒定
        3.6 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析
        3.7 目的蛋白的純化
    4 討論
        4.1 關(guān)于 NDV xx08 株 HN 主要抗原區(qū)基因片段
        4.2 關(guān)于原核表達(dá)條件的優(yōu)化
        4.3 關(guān)于蛋白純化
    5 小結(jié)
第四章 NDV 抗體檢測方法的建立
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果與分析
        2.1 最佳抗原包被濃度及血清稀釋度的確定
        2.2 酶標(biāo)二抗工作濃度的確定
        2.3 最佳血清反應(yīng)時間的確定
        2.4 最佳二抗反應(yīng)時間的確定
        2.5 間接 ELISA 臨界值的判定
        2.6 ELISA 方法特異性、敏感性和準(zhǔn)確性試驗
        2.7 交叉反應(yīng)實驗結(jié)果
        2.8 臨床血清樣品檢測
    3 討論
    4 小結(jié)
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄
致謝



本文編號：3858892