日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬,能夠引起人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和豬的繁殖障礙等疾病,在自然界中主要是通過蚊蟲叮咬進行傳播,蚊子是病毒的傳播宿主,水禽和豬是病毒主要的擴增宿主。根據(jù)病毒E基因序列可將JEV分為五個基因型,即基因I、II、III、IV、V型(GI、II、III、IV、V)。從上世紀30年代到20世紀末,GⅢ型毒株一直占據(jù)著亞洲地區(qū)JEV流行的主要地位,但最近二十年GⅠ型JEV逐漸替代GⅢ型成為我國乃至整個亞洲地區(qū)的主要流行毒株,而對于基因型轉(zhuǎn)換的分子機制目前尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn),GⅠ型JEV相對于GⅢ型在水禽宿主中具有適應(yīng)性的優(yōu)勢,能夠引起雛鴨產(chǎn)生滴度更高、持續(xù)時間更長的病毒血癥,而宿主適應(yīng)性的差異被認為可能是引起JEV基因型轉(zhuǎn)換的一個重要的原因。為解析GⅠ型與GⅢ型JEV在水禽宿主中適應(yīng)性差異的分子基礎(chǔ),本研究首先建立了GⅠ型與GⅢ型JEV PCR-Based反向遺傳學(xué)系統(tǒng)。GⅠ型與GⅢ型JEV基因組全序列的同源性約為88.9%,存在12.3%的差異性,而基因組序列間的差異,限制了酶切位點的選擇,為后期G...

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 乙型腦炎概述
        1.1.1 乙型腦炎流行病學(xué)特征
        1.1.2 乙型腦炎的臨床癥狀與病理變化
        1.1.3 乙型腦炎的防控措施
    1.2 乙型腦炎病毒
        1.2.1 乙型腦炎病毒的形態(tài)、理化及生物特性
        1.2.2 乙型腦炎病毒基因組結(jié)構(gòu)及其功能
        1.2.3 乙型腦炎病毒復(fù)制周期
        1.2.4 乙型腦炎病毒基因型分布及基因型轉(zhuǎn)換
    1.3 黃病毒感染性克隆研究進展
    1.4 乙型腦炎病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的應(yīng)用
    1.5 黃病毒逃逸天然免疫的分子機制
    1.6 本研究的目的與意義
第二章 GⅠ型與GⅢ型 JEV PCR-Based反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立
    2.1 材料與方法
        2.1.1 病毒、細胞、質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 病毒的擴增
        2.1.5 病毒RNA的提取
        2.1.6 GⅠ型與GⅢ型 JEV第一鏈c DNA合成
        2.1.7 GⅠ型與GⅢ型 JEV基因組的分段克隆
        2.1.8 GⅠ型與GⅢ型 JEV全長c DNA的克隆
        2.1.9 病毒的拯救
        2.1.10 拯救病毒的間接免疫熒光鑒定
        2.1.11 拯救病毒的多步生長曲線
        2.1.12 病毒蝕斑試驗
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 GI與 GⅢ型 JEV基因組序列的同源性分析及引物保守型分析
        2.2.2 GⅠ型與GⅢ型 JEV基因組分段擴增與克隆
        2.2.3 病毒全長cDNA擴增
        2.2.4 rGI與rGIII JEV的拯救與鑒定
        2.2.5 被拯救病毒與親本毒生長特性的比較
    2.3 討論
第三章 GI與 GⅢ型 JEV在水禽宿主中誘導(dǎo)IFN-I表達的差異
    3.1 材料與方法
        3.1.1 病毒、細胞、實驗動物
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 鴨胚成纖維細胞的制備
        3.1.5 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        3.1.6 熒光定量PCR檢測Ⅰ型干擾素表達
        3.1.7 ELISA方法檢測Ⅰ型干擾素的表達量
        3.1.8 細胞上清中病毒滴度測定
        3.1.9 細胞中病毒蛋白水平測定
        3.1.10 雛鴨動物實驗
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 三種細胞感染JEV后間接免疫熒光驗證
        3.2.2 GⅠ型與GⅢ型 JEV誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素表達的差異
        3.2.4 GⅠ型與GⅢ型 JEV在宿主細胞中病毒滴度的測定
        3.2.5 GⅠ型與GⅢ型 JEV在雛鴨體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素表達的差異
    3.3 討論
第四章 GⅠ型與GⅢ型 JEV誘導(dǎo)水禽宿主IFN-I表達差異的分子基礎(chǔ)
    4.1 材料與方法
        4.1.1 細胞、質(zhì)粒、病毒
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 GⅠ型與GⅢ型 JEV氨基酸序列的比對分析
        4.1.5 嵌合病毒與定點突變病毒的構(gòu)建
        4.1.6 嵌合病毒與定點突變病毒在DEF中誘導(dǎo)IFN-I表達能力分析
        4.1.7 嵌合病毒與定點突變病毒復(fù)制動力學(xué)分析
        4.1.8 嵌合病毒與定點突變病毒的空斑形成試驗
        4.1.9 GⅠ型與GⅢ型 JEV NS5 蛋白拮抗IFN-I表達能力分析
        4.1.10 小鼠動物實驗
        4.1.11 雛鴨動物實驗
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 GⅠ型與GⅢ型 JEV差異性氨基酸位點分析
        4.2.2 GⅠ型與GⅢ型 JEV間結(jié)構(gòu)蛋白相互替換嵌合病毒的構(gòu)建及拯救
        4.2.3 結(jié)構(gòu)蛋白相互替換的嵌合病毒誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素能力分析
        4.2.4 結(jié)構(gòu)蛋白相互替換的嵌合病毒復(fù)制動力學(xué)分析
        4.2.5 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS2B/NS3、NS4A/NS4B、NS5 相互替換的嵌合病毒構(gòu)建
        4.2.6 非結(jié)構(gòu)蛋白NS5 決定GⅠ型與GⅢ型 JEV誘導(dǎo)IFN-I表達的差異
        4.2.7 非結(jié)構(gòu)蛋白NS5 決定GⅠ型 JEV在 DEF細胞中的復(fù)制優(yōu)勢
        4.2.8 NS5-a-a Rd Rp區(qū)域決定GI與 GⅢ型 JEV誘導(dǎo)IFN-I表達的差異
        4.2.9 NS5-a-a Rd Rp區(qū)域決定GⅠ型 JEV在 DEF中的復(fù)制優(yōu)勢
        4.2.10 NS5-372-386 位點共同決定GⅠ型與GⅢ型 JEV在 DEF中誘導(dǎo)IFN-表達的差異
        4.2.11 NS5-372-386 位點共同決定GⅠ型與GⅢ型 JEV在 DEF中復(fù)制差異.
        4.2.12 NS5-V372A-H386Y位點突變不改變病毒對小鼠的毒力
        4.2.13 NS5-372V-386H位點決定GⅠ型 JEV在雛鴨宿主中適應(yīng)性的優(yōu)勢
    4.3 討論
第五章 NS5-V372A-H386Y決定水禽宿主IFN-I表達差異的分子機制
    5.1 材料與方法
        5.1.1 細胞、質(zhì)粒、病毒
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器
        5.1.4 細胞核與細胞質(zhì)蛋白分離
        5.1.5 鴨源核轉(zhuǎn)運受體蛋白與鴨源IRF7分子的克隆表達
        5.1.6 鴨源核轉(zhuǎn)運受體蛋白與JEVNS5蛋白分子的互作
        5.1.7 鴨源核轉(zhuǎn)運受體蛋白與duIRF7分子的互作
        5.1.8 鴨源核轉(zhuǎn)運受體蛋白du KPNA4與du IRF7 共定位實驗
        5.1.9 鴨源核轉(zhuǎn)運受體蛋白du KPNA4對Ⅰ型干擾素表達的作用
        5.1.10 GⅠ型與GⅢ型 JEV NS5-372 與386 位點的同性氨基酸替代
        5.1.11 NS5-372-386 位點突變病毒的誘導(dǎo)IFN-I表達能力分析
        5.1.12 NS5-372-386位點突變病毒的復(fù)制動力學(xué)分析
        5.1.13 NS5-372-386位點突變病毒的空斑形成試驗
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 GⅠ型與GⅢ型 JEV NS5 蛋白核定位能力分析
        5.2.2 GⅠ型與GⅢ型 NS5 蛋白與du KPNA2、du KPNA3、du KPNA4 互作
        5.2.3 鴨源IRF7 分子與核轉(zhuǎn)運受體蛋白du KPNA4 互作
        5.2.4 GⅠ型與GⅢ型 JEV NS5 蛋白不與du IRF7 分子互作
        5.2.5 du KPNA4 促進du IRF7 分子入核啟始IFN-I表達
        5.2.6 NS5-372-386 位點決定NS5 蛋白與du KPNA4 的結(jié)合能力
        5.2.7 NS5-372-386 氫鍵排布決定GⅠ型與GⅢ型 JEV對水禽宿主適應(yīng)性
    5.3 討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3854357