誘導多能干細胞技術主要涉及兩個方面,一方面是利用外源特定轉錄因子導入受體細胞,激活受體細胞的內(nèi)源基因表達,改變相關的表觀遺傳印記,使細胞處于一種不穩(wěn)定的中間活化狀態(tài)；另一方面是通過特定的培養(yǎng)條件,將處于中間活化狀態(tài)的細胞向特定方向進行誘導和篩選,根據(jù)所提供的多能干細胞特定培養(yǎng)條件,篩選出與胚胎干細胞相類似的誘導型多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。 目前豬誘導型多能干細胞(piPSCs)不同細胞系之間差異較大,特征難以統(tǒng)一,所得到的大部分piPSCs細胞系均未能實現(xiàn)外源基因的沉默,雖然有報道piPSCs可以進行嵌合體實驗,至今卻沒有得到其他實驗室的重復,更令人奇怪的是piPSCs的核移植胚胎發(fā)育率遠遠低于正常的體細胞,并且克隆胚胎的體內(nèi)發(fā)育率更是極低,不能達到小鼠iPSCs細胞的多能性水平,這也使piPSCs細胞在轉基因豬生產(chǎn)和建立疾病模型方面的應用受到限制。此外,豬胚胎干細胞的研究進展緩慢,沒有公認的豬胚胎干細胞及合適的培養(yǎng)系統(tǒng)作為參考,且豬發(fā)育生物學上研究的不充分,使得piPSCs在體外的多能性維持較為困難。 基于誘導多能干細胞...

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 哺乳動物多能性干細胞研究概況
    1.2 誘導多能性干細胞技術的研究進展
        1.2.1 核移植技術
        1.2.2 誘導多能性干細胞技術
    1.3 小鼠誘導型多能干細胞
    1.4 人誘導型多能干細胞
    1.5 豬誘導型多能干細胞
    1.6 不同實驗室誘導的豬多能干細胞比較
    1.7 豬誘導型多能干細胞存在的問題
    1.8 本研究在豬遺傳育種中的重要意義
        1.8.1 豬ESC建立
        1.8.2 轉基因豬生產(chǎn)
        1.8.3 豬遺傳資源保存與利用
第二章 兩種來源piPSCs產(chǎn)生效率和體外增殖能力的影響因素研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 藥品與試劑
        2.1.3 主要實驗儀器
        2.1.4 巴馬小型豬耳緣組織成纖維細胞培養(yǎng)
        2.1.5 巴馬小型豬骨髓間充質干細胞分離培養(yǎng)
        2.1.6 慢病毒包裝和滴度測定
        2.1.7 慢病毒誘導巴馬小型豬成纖維細胞/骨髓間充質干細胞來源多能性干細胞
        2.1.8 巴馬小型豬iPSCs鑒定
        2.1.9 不同飼養(yǎng)層對巴馬小型豬iPSCs體外增殖能力的影響
        2.1.10 傳代方式對巴馬小型豬iPSCs增殖能力的影響
        2.1.11 ROCK抑制劑對巴馬小型豬iPSCs凍存復蘇率的影響
        2.1.12 細胞周期蛋白對巴馬小型豬iPSCs增殖的影響
        2.1.13 克隆形成率計算
        2.1.14 克隆倍增時間的計算
        2.1.15 數(shù)據(jù)分析
    2.2 結果
        2.2.1 巴馬小型豬耳緣組織成纖維細胞和骨髓間充質干細胞分離培養(yǎng)
        2.2.2 多能性基因比對分析及其慢病毒載體鑒定
        2.2.3 慢病毒的包裝及滴度測定
        2.2.4 慢病毒感染復數(shù)的確定
        2.2.5 慢病毒誘導巴馬小型豬成纖維細胞/骨髓間充質干細胞來源多能性干細胞
        2.2.6 豬成纖維細胞和骨髓間充質干細胞誘導多能干細胞的形態(tài)學觀察
        2.2.7 堿性磷酸酶活性檢測
        2.2.8 干細胞表面標記的免疫熒光檢測
        2.2.9 干細胞內(nèi)外源基因的表達分析
        2.2.10 核型分析
        2.2.11 類胚體形成實驗
        2.2.12 巴馬小型豬iPSCs體外分化能力檢測
        2.2.13 巴馬小型豬iPSCs畸胎瘤形成實驗
        2.2.14 不同飼養(yǎng)層對豬誘導型多能干細胞體外增殖能力的影響
        2.2.15 傳代方式對豬誘導型多能性干細胞增殖能力的影響
        2.2.16 ROCK抑制劑對豬誘導型多能性干細胞復蘇率的影響
        2.2.17 細胞周期蛋白對豬誘導型多能性干細胞增殖的影響
    2.3 討論
第三章 兩種狀態(tài)piPSCs的生物學特性和分子調控機制研究
    3.1 材料
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 試劑的配制
        3.1.4 主要儀器及耗材
    3.2 試驗方法
        3.2.1 piPB4-6細胞的培養(yǎng)
        3.2.2 小鼠ES細胞樣豬iPS細胞的獲得及培養(yǎng)
        3.2.3 單位面積克隆數(shù)的統(tǒng)計
        3.2.4 細胞活性分析
        3.2.5 單克隆形成率
        3.2.6 piPB4-6_m細胞的鑒定分析
        3.2.7 X染色體狀態(tài)的檢測
        3.2.8 piPB4-6_h和piPB4-6_m細胞信號通路相關基因表達模式
        3.2.9 piPB4-6_h和piPB4-6_m的DLK-DIO3印記區(qū)間檢測
        3.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
    3.3 結果
        3.3.1 小鼠ES細胞樣豬iPSCs的培養(yǎng)
        3.3.2 單位面積克隆數(shù)的統(tǒng)計
        3.3.3 細胞活性分析
        3.3.4 單細胞克隆形成率
        3.3.5 piPB4-6_m細胞的鑒定分析
        3.3.7 piPB4-6_m和piPB4-6_h X染色體狀態(tài)的檢測
        3.3.8 piPB4-6_m和piPB4-6_h細胞信號通路相關基因表達模式
        3.3.9 piPB4-6_m和piPB4-6_h的DLK-D103印記區(qū)間檢測
    3.4. 討論
結論
參考文獻
致謝
博士、博士后期間發(fā)表論文
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本文編號：3842325