誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)主要涉及兩個方面,一方面是利用外源特定轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入受體細(xì)胞,激活受體細(xì)胞的內(nèi)源基因表達(dá),改變相關(guān)的表觀遺傳印記,使細(xì)胞處于一種不穩(wěn)定的中間活化狀態(tài)；另一方面是通過特定的培養(yǎng)條件,將處于中間活化狀態(tài)的細(xì)胞向特定方向進(jìn)行誘導(dǎo)和篩選,根據(jù)所提供的多能干細(xì)胞特定培養(yǎng)條件,篩選出與胚胎干細(xì)胞相類似的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。 目前豬誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(piPSCs)不同細(xì)胞系之間差異較大,特征難以統(tǒng)一,所得到的大部分piPSCs細(xì)胞系均未能實現(xiàn)外源基因的沉默,雖然有報道piPSCs可以進(jìn)行嵌合體實驗,至今卻沒有得到其他實驗室的重復(fù),更令人奇怪的是piPSCs的核移植胚胎發(fā)育率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常的體細(xì)胞,并且克隆胚胎的體內(nèi)發(fā)育率更是極低,不能達(dá)到小鼠iPSCs細(xì)胞的多能性水平,這也使piPSCs細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)和建立疾病模型方面的應(yīng)用受到限制。此外,豬胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展緩慢,沒有公認(rèn)的豬胚胎干細(xì)胞及合適的培養(yǎng)系統(tǒng)作為參考,且豬發(fā)育生物學(xué)上研究的不充分,使得piPSCs在體外的多能性維持較為困難。 基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞...

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 哺乳動物多能性干細(xì)胞研究概況
    1.2 誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.2.1 核移植技術(shù)
        1.2.2 誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞技術(shù)
    1.3 小鼠誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞
    1.4 人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞
    1.5 豬誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞
    1.6 不同實驗室誘導(dǎo)的豬多能干細(xì)胞比較
    1.7 豬誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞存在的問題
    1.8 本研究在豬遺傳育種中的重要意義
        1.8.1 豬ESC建立
        1.8.2 轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)
        1.8.3 豬遺傳資源保存與利用
第二章 兩種來源piPSCs產(chǎn)生效率和體外增殖能力的影響因素研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 藥品與試劑
        2.1.3 主要實驗儀器
        2.1.4 巴馬小型豬耳緣組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
        2.1.5 巴馬小型豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)
        2.1.6 慢病毒包裝和滴度測定
        2.1.7 慢病毒誘導(dǎo)巴馬小型豬成纖維細(xì)胞/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源多能性干細(xì)胞
        2.1.8 巴馬小型豬iPSCs鑒定
        2.1.9 不同飼養(yǎng)層對巴馬小型豬iPSCs體外增殖能力的影響
        2.1.10 傳代方式對巴馬小型豬iPSCs增殖能力的影響
        2.1.11 ROCK抑制劑對巴馬小型豬iPSCs凍存復(fù)蘇率的影響
        2.1.12 細(xì)胞周期蛋白對巴馬小型豬iPSCs增殖的影響
        2.1.13 克隆形成率計算
        2.1.14 克隆倍增時間的計算
        2.1.15 數(shù)據(jù)分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 巴馬小型豬耳緣組織成纖維細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)
        2.2.2 多能性基因比對分析及其慢病毒載體鑒定
        2.2.3 慢病毒的包裝及滴度測定
        2.2.4 慢病毒感染復(fù)數(shù)的確定
        2.2.5 慢病毒誘導(dǎo)巴馬小型豬成纖維細(xì)胞/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源多能性干細(xì)胞
        2.2.6 豬成纖維細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
        2.2.7 堿性磷酸酶活性檢測
        2.2.8 干細(xì)胞表面標(biāo)記的免疫熒光檢測
        2.2.9 干細(xì)胞內(nèi)外源基因的表達(dá)分析
        2.2.10 核型分析
        2.2.11 類胚體形成實驗
        2.2.12 巴馬小型豬iPSCs體外分化能力檢測
        2.2.13 巴馬小型豬iPSCs畸胎瘤形成實驗
        2.2.14 不同飼養(yǎng)層對豬誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞體外增殖能力的影響
        2.2.15 傳代方式對豬誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞增殖能力的影響
        2.2.16 ROCK抑制劑對豬誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞復(fù)蘇率的影響
        2.2.17 細(xì)胞周期蛋白對豬誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞增殖的影響
    2.3 討論
第三章 兩種狀態(tài)piPSCs的生物學(xué)特性和分子調(diào)控機(jī)制研究
    3.1 材料
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 試劑的配制
        3.1.4 主要儀器及耗材
    3.2 試驗方法
        3.2.1 piPB4-6細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.2.2 小鼠ES細(xì)胞樣豬iPS細(xì)胞的獲得及培養(yǎng)
        3.2.3 單位面積克隆數(shù)的統(tǒng)計
        3.2.4 細(xì)胞活性分析
        3.2.5 單克隆形成率
        3.2.6 piPB4-6_m細(xì)胞的鑒定分析
        3.2.7 X染色體狀態(tài)的檢測
        3.2.8 piPB4-6_h和piPB4-6_m細(xì)胞信號通路相關(guān)基因表達(dá)模式
        3.2.9 piPB4-6_h和piPB4-6_m的DLK-DIO3印記區(qū)間檢測
        3.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 小鼠ES細(xì)胞樣豬iPSCs的培養(yǎng)
        3.3.2 單位面積克隆數(shù)的統(tǒng)計
        3.3.3 細(xì)胞活性分析
        3.3.4 單細(xì)胞克隆形成率
        3.3.5 piPB4-6_m細(xì)胞的鑒定分析
        3.3.7 piPB4-6_m和piPB4-6_h X染色體狀態(tài)的檢測
        3.3.8 piPB4-6_m和piPB4-6_h細(xì)胞信號通路相關(guān)基因表達(dá)模式
        3.3.9 piPB4-6_m和piPB4-6_h的DLK-D103印記區(qū)間檢測
    3.4. 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
博士、博士后期間發(fā)表論文
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本文編號：3842325