為探究水貂細(xì)小病毒(MEV)VP2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)MEV VP2蛋白進(jìn)行原核表達(dá)并純化,用ELISA初步評(píng)價(jià)重組蛋白在血清學(xué)診斷中的價(jià)值。通過大腸埃希菌表達(dá)外源基因的方法構(gòu)建MEV VP2原核表達(dá)體系,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到以包涵體形式存在的目的蛋白,對(duì)蛋白進(jìn)行純化、透析復(fù)性并鑒定;加入分子伴侶pTf16質(zhì)粒構(gòu)建共表達(dá)系統(tǒng),優(yōu)化表達(dá)條件以提升可溶性目的蛋白的表達(dá)量,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化及鑒定。將純化后的可溶性蛋白、復(fù)性后的包涵體蛋白及純化后的全病毒蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板,用間接ELISA方法對(duì)MEV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè),初步對(duì)比評(píng)價(jià)3種抗原的血清學(xué)診斷價(jià)值。結(jié)果表明,經(jīng)過雙酶切和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建重組蛋白原核表達(dá)載體;重組VP2蛋白的分子質(zhì)量約為67ku;優(yōu)化誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)試劑濃度未能解決包涵體表達(dá)問題;構(gòu)建了共表達(dá)系統(tǒng),優(yōu)化表達(dá)條件后可溶性目的蛋白的表達(dá)量得到明顯提高;SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果表明,兩種重組蛋白皆具有良好的反應(yīng)原性;間接ELISA結(jié)果表明可溶性表達(dá)蛋白更適合作為MEV的候選診斷抗原。通過分子伴侶共表達(dá)和包涵體蛋白復(fù)性的方法獲得了大量有活性的目的...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 病毒及血清
        1.1.2 主要試劑及儀器
    1.2 方法
        1.2.1 目的基因及引物合成
        1.2.2 VP2基因的擴(kuò)增與表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.3 重組蛋白的表達(dá)
        1.2.4 包涵體的純化與復(fù)性
        1.2.5 分子伴侶共表達(dá)體系的構(gòu)建及純化
        1.2.6 重組蛋白活性檢測(cè)
        1.2.7 重組蛋白的血清學(xué)初步評(píng)價(jià)
        1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
2 結(jié)果
    2.1 VP2基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.2 包涵體蛋白與可溶性蛋白的SDS-PAGE分析
    2.3 包涵體蛋白和可溶性蛋白的純化及Western blot鑒定
        2.3.1 可溶性蛋白純化
        2.3.2 包涵體蛋白的純化與復(fù)性
        2.3.3 Western blot鑒定
    2.4 間接ELISA方法評(píng)價(jià)
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