豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是一種無囊膜的小型單鏈環(huán)狀DNA病毒,病毒粒子為17 nm左右。PCV分為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)。與PCV2相關(guān)的一系疾病,如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)等稱PCVD。PCVD給養(yǎng)豬業(yè)造成的危害重大,至今疫苗免疫仍然是防控PCV2的主要手段。國內(nèi)PCV2疫苗主要為滅活苗,價格偏高,且難以將豬體內(nèi)已感染的PCV2徹底清除,所誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體不能與野毒抗體相區(qū)別。因此,研發(fā)高效廉價的,所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能與野毒抗體相區(qū)分的亞單位疫苗具有重要意義。PCV2的ORF2編碼233或234個氨基酸殘基構(gòu)成的PCV2 Cap蛋白是PCV2的唯一結(jié)構(gòu)蛋白,也是主要免疫原性蛋白(Mankertz A et al.,1998),Cap蛋白已被研制成PCV2亞單位疫苗使用。本研究致力于構(gòu)建能表達(dá)攜帶標(biāo)記的PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒,所獲得的標(biāo)記蛋白可為PCV2亞單位疫苗的研究提供素材:1.PCV2 GZ-RH1株ORF2生物信息學(xué)分析及Flag表位標(biāo)簽的引入為了解PCV2 GZ-R...

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 豬圓環(huán)病毒研究進(jìn)展
        1.1 病原學(xué)
        1.2 流行病學(xué)
        1.3 PCVD的防治及疫苗研究狀況
            1.3.1 商品化PCV2疫苗
            1.3.2 新型疫苗的研發(fā)
    2 昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)
        2.1 桿狀病毒載體
            2.1.1 桿狀病毒
            2.1.2 桿狀病毒載體的構(gòu)建
        2.2 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3 昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用
    3 V5與Flag表位標(biāo)簽概述
    4 研究目的及意義
第二章 PCV2 ORF2基因的生物信息學(xué)分析及Flag表位標(biāo)簽的引入
    1 材料
        1.1 PCV2基因組核苷酸序列
        1.2 生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫
        1.3 菌株、毒株及主要試劑
        1.4 實驗主要儀器設(shè)備
    2 方法
        2.1 特異性引物
        2.2 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因分析
        2.3 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因編碼的氨基酸分析
        2.4 PCV2 GZ-RH1株的ORF2基因密碼子偏好性分析
        2.5 pMD19-T-PCV2質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
            2.5.1 病毒DNA的提取
            2.5.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.5.3 pMD19-T-PCV2質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.6 pMD19-T-PCV2-Flag質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
    3 結(jié)果
        3.1 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因的核苷酸序列分析
        3.2 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因的核苷酸及氨基酸同源性分析
        3.3 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
        3.4 PCV2 GZ-RH1株ORF2編碼的蛋白預(yù)測分析
            3.4.1 ORF2編碼的Cap蛋白基本特性分析
            3.4.2 ORF2編碼的Cap蛋白潛在磷酸化位點
            3.4.3 ORF2編碼的蛋白基序和結(jié)構(gòu)域分析
            3.4.4 PCV2編碼的Cap蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析
        3.5 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因密碼子偏愛性分析
        3.6 pMD19-T-PCV2質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.7 pMD19-T-PCV2-Flag質(zhì)粒的構(gòu)建
    4 討論
    5 結(jié)論
第三章 攜帶標(biāo)記的PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
    1 材料
        1.1 毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞
        1.2 主要試劑
        1.3 實驗主要儀器
    2 方法
        2.1 V5和Flag標(biāo)記的Cap蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測與引物設(shè)計
        2.2 標(biāo)記PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建策略
        2.3 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及鑒定
            2.3.1 ORF2-V5、ORF2-Flag的T克隆
            2.3.2 pFastBacHTA-ORF2-V5與pFastBacHTA-ORF2-Flag的構(gòu)建及鑒定
        2.4 桿粒rBacmid-Cap-V5和rBacmid-Cap-Flag的制備
        2.5 Sf-9細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及病毒粒子收集
        2.7 昆蟲桿狀病毒粒子的觀察
        2.8 感染桿狀病毒的Sf-9細(xì)胞的IFA檢測
        2.9 重組標(biāo)記蛋白表達(dá)的Western-blotting檢測
    3 結(jié)果
        3.1 V5和Flag標(biāo)記的Cap蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.2 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及鑒定
            3.2.1 ORF2-V5、ORF2-Flag的T克隆
            3.2.2 pFastBacHTA-ORF2-V5與pFastBacHTA-ORF2-Flag的構(gòu)建及鑒定
        3.3 rBacmid-Cap-V5和rBacmid-Cap-Flag的制備
        3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及病毒粒子收集
        3.5 重組桿狀病毒的透射電子顯微鏡觀察
        3.6 感染桿狀病毒的Sf-9細(xì)胞的IFA檢測
        3.7 Western-blotting試驗結(jié)果
    4 討論
    5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄一 攻讀碩士學(xué)位期間所獲成果
致謝



本文編號：3836662