胚胎干細胞為基因功能、生物發(fā)育學以及生理學等研究提供了一個有力的工具。人類胚胎干細胞的出現(xiàn)也為再生醫(yī)學治療提供了一個很好的材料和模型，因為胚胎干細胞能夠向機體內(nèi)的幾乎所有組織和器官發(fā)育與分化。但是，目前大部分哺乳動物如山羊尚沒有建系的胚胎干細胞，其嚴重制約了轉(zhuǎn)基因山羊等技術的快速發(fā)展。誘導多能干細胞在小鼠、大鼠和人等動物上的成功，促進了多能性干細胞和轉(zhuǎn)基因動物等研究。但目前，山羊體細胞的重編程效率很低，其體細胞的重編程機制仍然不夠清楚，并且可能存在不同于小鼠和人體細胞重編程的特點。 在細胞水平上，蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶有許多生理功能，它們能夠影響細胞分化和發(fā)育，生長與增殖。有預測顯示，哺乳動物基因組中有占1％的基因編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，這表明這類酶在體內(nèi)發(fā)揮重要作用。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)ΨQ和不對稱甲基化組蛋白和非組蛋白。它們中的大部分成員能夠調(diào)節(jié)染色體結(jié)構，并控制一類基因的轉(zhuǎn)錄和沉默。與其它蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶不同，PRMT5能夠協(xié)同作用于許多蛋白基團，來調(diào)節(jié)體內(nèi)、體外的表觀遺傳改變。已有很多進展顯示PRMT5能夠調(diào)控細胞增殖和促進細胞生存。作為一個調(diào)節(jié)酶，PRMT5從表觀層遺傳上發(fā)揮著調(diào)節(jié)...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻綜述
    第一章 多能性干細胞及 PRMT5 研究進展
        1.1 多能性干細胞研究進展
            1.1.1 胚胎干細胞
            1.1.2 誘導性多能干細胞研究現(xiàn)狀
            1.1.3 奶山羊干細胞相關研究
        1.2 PRMT5 的研究進展
            1.2.1 精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶
            1.2.2 PRMT5 的功能及作用機理
            1.2.3 PRMT5 影響多能性的研究進展
        1.3 小結(jié)與展望
試驗研究
    第二章 奶山羊 PRMT5 慢病毒載體構建及基因分析
        2.1 材料和方法
            2.1.1 實驗動物
            2.1.2 主要儀器設備
            2.1.3 主要試劑
            2.1.4 主要溶液的配制
            2.1.5 PRMT5 在奶山羊不同組織的表達及定位檢測
            2.1.6 pCDH-CMV-PRMT5-EF1-GreenPuro 載體構建
            2.1.7 病毒包裝及病毒感染后檢測
        2.2 結(jié)果
            2.2.1 QRT-PCR 檢測 PRMT5 在奶山羊不同組織的表達
            2.2.2 PRMT5 在奶山羊睪丸和卵巢組織的表達定位
            2.2.3 載體構建及生物信息學分析
            2.2.4 GEF 細胞超表達 PRMT5 后免疫熒光及半定量檢測 PRMT5 表達情況
        2.3 討論
        2.4 小結(jié)
    第三章 奶山羊胚胎成纖維細胞重編程
        3.1 材料和方法
            3.1.1 主要儀器
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 主要溶液配制
            3.1.4 GEF 的分離及慢病毒包裝
            3.1.5 不同轉(zhuǎn)染試劑及方法對奶山羊胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)染效果比較
            3.1.6 奶山羊胚胎成纖維細胞重編程
            3.1.7 多能性細胞鑒定
            3.1.8 類胚體生成及向三胚層分化檢測
        3.2 結(jié)果
            3.2.1 GEF 細胞形態(tài)學觀察
            3.2.2 不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染奶山羊胚胎成纖維細胞效果比較
            3.2.3 重編程過程不同階段細胞形態(tài)結(jié)果
            3.2.4 重編程細胞多能性檢測結(jié)果
            3.2.5 重編程細胞向三胚層分化的免疫熒光檢測結(jié)果
        3.3 討論
        3.4 小結(jié)
    第四章 PRMT5 通過影響 P53 信號通路影響重編程
        4.1 材料和方法
            4.1.1 GEF 細胞超表達 PRMT5
            4.1.2 RT-PCR 檢測
            4.1.3 細胞周期檢測
            4.1.4 Western Blot 檢測
            4.1.5 超表達 PRMT5 對 GEF 重編程時細胞 AP 陽性率的檢測
            4.1.6 超表達 PRMT5 細胞對克隆形成的影響
            4.1.7 P53 抑制劑對細胞增殖和 PRMT5 表達量的影響
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 細胞形態(tài)觀察
            4.2.2 細胞周期結(jié)果
            4.2.3 PCR 和 QRT-PCR 結(jié)果
            4.2.4 Western Blot 結(jié)果
            4.2.5 超表達 PRMT5 對誘導山羊胚胎成纖維細胞的影響
            4.2.6 P53 抑制劑能夠促進細胞增殖，并且能夠降低 PRMT5 的表達
        4.3 討論
        4.4 小結(jié)
結(jié)論
本文研究的創(chuàng)新點及進一步研究的課題
    創(chuàng)新點
    進一步研究課題
參考文獻
致謝
作者簡介及研究生期間工作進展



本文編號：3834016