水貂細(xì)小病毒(MEV)也稱水貂細(xì)小腸炎病毒,主要引起水貂劇烈腹瀉,有時(shí)伴有嘔吐,是危害我國(guó)養(yǎng)貂業(yè)的主要疾病之一,對(duì)養(yǎng)貂業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。加拿大學(xué)者Schofield首次發(fā)現(xiàn)本病。目前該病還沒(méi)有切實(shí)有效的治療手段,預(yù)防以疫苗接種為主。因此,我們開(kāi)展了水貂細(xì)小腸炎病毒主要抗原保護(hù)性蛋白VP2抗原表位富集區(qū)的克隆、原核表達(dá)與純化,以及單克隆抗體制備,在此基礎(chǔ)上,研制出可以用于水貂細(xì)小病毒感染初期快速診斷的ELISA試劑盒。 VP2蛋白是MEV主要結(jié)構(gòu)蛋白,也是病毒衣殼的主要組分,暴露在衣殼蛋白表面,是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要靶蛋白。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)分析軟件分析水貂細(xì)小病毒VP2基因上的主要抗原位點(diǎn),針對(duì)編碼的主要抗原位點(diǎn)設(shè)計(jì)了三對(duì)特異性引物,分別擴(kuò)增Loop1、Loop2、Loop3基因,然后將克隆的基因插入到表達(dá)載體pET-32a中,轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)PLysS表達(dá)菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),超聲處理后10000rpm離心,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明截短的三條VP2基因均獲得了較好的可溶性表達(dá),尤其是Loop3基因可溶性效果最好,表達(dá)的重組蛋白大小約為32KDa左右,其中目...

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第1章 水貂細(xì)小病毒概述
    1.1 水貂細(xì)小病毒病原學(xué)特征
        1.1.1 MEV的形態(tài)及理化特性
        1.1.2 MEV的血凝性
        1.1.3 MEV的抗原性
        1.1.4 MEV的培養(yǎng)特性
    1.2 水貂細(xì)小病毒的分子生物學(xué)特性
        1.2.1 MEV基因組特征
        1.2.2 MEV編碼的蛋白質(zhì)
    1.3 水貂病毒性腸炎研究進(jìn)展
        1.3.1 水貂病毒性腸炎的流行病學(xué)
        1.3.2 水貂病毒性腸炎的臨床癥狀及病理變化
        1.3.3 水貂細(xì)小病毒的診斷方法
        1.3.4 水貂細(xì)小病毒的防治措施
    1.4 單克隆抗體研究進(jìn)展
        1.4.1 鼠源單克隆抗體
        1.4.2 人源單克隆抗體
        1.4.3 基因工程單克隆抗體
第2章 水貂細(xì)小病毒VP2基因片段表達(dá)
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 毒株、載體、菌種
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 主要溶液的配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 水貂細(xì)小病毒DNA的提取
        2.2.2 引物設(shè)計(jì)
        2.2.3 目的片段的回收
        2.2.4 VP2目的片段與PMD18-T載體連接
        2.2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.6 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.2.7 質(zhì)粒雙酶切鑒定
        2.2.8 重組質(zhì)粒pET32a-Loop1、pET32a-Loop2、pET32a-Loop3的構(gòu)建
        2.2.9 重組蛋白的原核表達(dá)
        2.2.10 重組蛋白的純化及鑒定
        2.2.11 間接ELISA檢測(cè)重組蛋白的抗原性
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 PCR擴(kuò)增
        2.3.2 重組基因鑒定
        2.3.3 重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        2.3.4 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果
        2.3.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.3.6 重組蛋白過(guò)柱純化
        2.3.7 間接ELISA對(duì)重組蛋白抗原性的鑒定
    2.4 討論
第3章 MEV VP2基因特異性單克隆抗體制備
    3.1 材料和方法
        3.1.1 細(xì)胞系和菌株
        3.1.2 主要試劑和材料
        3.1.3 主要試劑配制
        3.1.4 病毒的增殖和濃縮
        3.1.5 動(dòng)物免疫
        3.1.6 間接ELISA檢測(cè)方法的優(yōu)化
        3.1.7 細(xì)胞融合
            3.1.7.1 制備飼養(yǎng)細(xì)胞
            3.1.7.2 制備脾細(xì)胞
        3.1.8 骨髓瘤細(xì)胞SP2/0處理
        3.1.9 脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合
        3.1.10 融合細(xì)胞培養(yǎng)
    3.2 陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞篩選
        3.2.1 雜交瘤細(xì)胞亞克隆化
        3.2.2 雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)
        3.2.3 雜交瘤細(xì)胞的凍存
        3.2.4 雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇
    3.3 單克隆抗體腹水的制備
        3.3.1 腹水單克隆抗體的純化濃縮
    3.4 單克隆抗體鑒定
        3.4.1 特異性試驗(yàn)鑒定
        3.4.2 單克隆抗體效價(jià)及濃度測(cè)定
        3.4.3 抗體濃度的測(cè)定
    3.5 結(jié)果與分析
        3.5.1 ELISA反應(yīng)體系優(yōu)化
            3.5.1.1 包被原濃度的確定
            3.5.1.2 封閉液濃度的確定
            3.5.1.3 酶標(biāo)二抗稀釋濃度的確定
        3.5.2 融合細(xì)胞小鼠選取
        3.5.3 陽(yáng)性細(xì)胞篩選
        3.5.4 腹水抗體效價(jià)測(cè)定
        3.5.5 腹水單克隆抗體特異性檢測(cè)
    3.6 討論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3832643