hTNF-α是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一,由于毒副作用較大、半衰期短、低劑量抗腫瘤效果不顯著等原因限制了臨床上的廣泛應用,但改造后的hTNF-α衍生物具有高效低毒的特點;hIFN-γ屬于Ⅱ型干擾素,具有廣譜的抗病毒作用,在醫(yī)學臨床上常用于病毒性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病的治療。禽類原始生殖細胞(PGCs)是配子的前體細胞,可以作為將外源基因轉(zhuǎn)入基因組和生殖系的有效載體,因為PGCs能夠通過血流靶向進入雜合子胚胎性索,將遺傳特性直接傳遞給后代。如果將生殖細胞的標志基因DAZL和CVH與目的基因體內(nèi)或體外共同導入PGCs,可能會提高這類細胞的生殖系傳遞能力,從而有助于解決轉(zhuǎn)基因雞效率低下的難題。方法:(1)從健康志愿者外周靜脈血分離出淋巴細胞培養(yǎng),培養(yǎng)液中添加脂多糖(LPS)激活巨噬細胞,用TRIzol法提取總RNA,運用RT-PCR技術克隆hTNF-α、hIFN-γ基因,并對hTNF-α基因進行突變改造;采用PCR技術從 pMD18-T-CVH、pMD18-T-DAZL 克隆雞 CVH 和 DAZL 基因。(2)應用MultiSite Gateway技術構建卵...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻綜述
    第一章 hTNF-α、hIFN-γ、CVH和雞DAZL基因研究進展
        1.1 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的研究進展
            1.1.1 腫瘤壞死因子-α的概述
            1.1.2 腫瘤壞死因子-α的生化特性
            1.1.3 腫瘤壞死因子-α基因組結構及表達
        1.2 人γ干擾素(hIFN-γ)的研究進展
            1.2.1 人γ干擾素(hIFN-γ)的概述
            1.2.2 hIFN-γ的分子生物學特性
            1.2.3 hIFN-γ的生物學作用
        1.3 CVH基因研究進展
            1.3.1 Vasa基因概述
            1.3.2 Vasa基因功能及作用機理
            1.3.3 Vasa基因的應用
            1.3.4 CVH基因表達
        1.4 DAZL基因研究進展
            1.4.1 DAZL基因概述
            1.4.2 DAZL基因的時空表達
            1.4.3 雞DAZL基因的保守表達
            1.4.4 DAZL基因與分子標記
            1.4.5 DAZL與生殖細胞調(diào)控
        1.5 研究的目的與意義
實驗研究
    第二章 hTNF-α、hIFN-γ、CVH、雞 DAZL 基因克隆
        2.1 前言
        2.2 材料與方法
            2.2.1 儀器設備
            2.2.2 實驗試劑
            2.2.3 常用溶液配制
            2.2.4 hTNF-α、hIFN-γ基因克隆
            2.2.5 CVH和雞DAZL基因的克隆
        2.3 結果與分析
            2.3.1 hTNF-α、hIFN-γ基因的RT-PCR
            2.3.2 pMD18-T-hTNF-α重組質(zhì)粒的構建
            2.3.3 TNF-α基因測序結果
            2.3.4 hTNF-α點突變PCR擴增
            2.3.5 CVH和雞DAZL基因PCR擴增
            2.3.6 入門載體構建
        2.4 討論
        2.5 小結
    第三章 慢病毒表達載體構建及體外表達
        3.1 前言
        3.2 材料與方法
            3.2.1 儀器設備
            3.2.2 實驗試劑
            3.2.3 常用溶液配制
            3.2.4 慢病毒表達載體構建
            3.2.5 慢病毒表達載體去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提
            3.2.6 慢病毒包裝及表達檢測
        3.3 結果與分析
            3.3.1 慢病毒載體酶切鑒定與測序結果
            3.3.2 去內(nèi)毒素慢病毒載體質(zhì)粒濃度及純度測定
            3.3.2 慢病毒載體表達檢測
        3.4 討論
        3.5 小結
參考文獻
致謝
作者簡介
攻讀碩士期間發(fā)表論文情況



本文編號：3830620