為了研究剛地弓形蟲(chóng)ROP18的生物學(xué)功能,并深入了解其在抵抗宿主天然免疫方面所發(fā)揮的作用,本研究進(jìn)行了弓形蟲(chóng)RH株ROP18基因的表達(dá)與鑒定。采用PCR方法擴(kuò)增ROP18的截短基因,將其克隆至原核表達(dá)載體pET-30a(+)中后,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并優(yōu)化表達(dá)條件,SDS-PAGE分析表達(dá)情況,重組蛋白純化后免疫小鼠制備多克隆抗體,通過(guò)Western blot及IFA鑒定重組蛋白的免疫活性。結(jié)果表明:以弓形蟲(chóng)RH株基因組DNA為模板,成功擴(kuò)增出長(zhǎng)約678 bp的ROP18截短基因,并構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-ROP18,測(cè)序結(jié)果與GenBank參考序列比對(duì),同源性為100%;SDS-PAGE結(jié)果顯示,重組蛋白R(shí)OP18以包涵體形式存在,分子質(zhì)量約為31 kDa,且在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h時(shí),表達(dá)量最高;Western blot結(jié)果顯示重組蛋白R(shí)OP18可被感染弓形蟲(chóng)的犬陽(yáng)性血清識(shí)別,表明ROP18有良好的反應(yīng)原性;IFA結(jié)果顯示,ROP18主要分布于弓形蟲(chóng)速殖子的胞漿內(nèi),且棒狀體常存在的部位呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株、菌種、質(zhì)粒與小鼠
    1.2 試劑與儀器
    1.3 弓形蟲(chóng)DNA的提取
    1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成
    1.5 ROP18基因的擴(kuò)增
    1.6 重組質(zhì)粒pET-30a-ROP18的構(gòu)建及鑒定
    1.7 重組蛋白的表達(dá)及可溶性鑒定
    1.8 重組蛋白R(shí)OP18的純化
    1.9 鼠抗重組蛋白R(shí)OP18多克隆抗體的制備
    1.10 重組蛋白R(shí)OP18的Western blot分析
    1.11 重組蛋白R(shí)OP18的間接免疫熒光試驗(yàn)分析
2 結(jié)果
    2.1 ROP18基因的擴(kuò)增
    2.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
        2.2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
    2.3 重組蛋白的表達(dá)及可溶性鑒定
    2.4 重組蛋白rROP18純化后SDS-PAGE分析
    2.5 重組蛋白rROP18的Western blot分析
    2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)分析
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