發(fā)布時間：2023-05-17 23:19

　　由于禽類獨特的生殖系統(tǒng),一個新生種雞蛋已經是一個包含六萬個左右細胞的雞胚。雞蛋的外殼堅硬,雞蛋黃大而脆弱,不像哺乳動物的卵子是透明的從而便于顯微注射操作。近年來隨著慢病毒的廣泛應用和雞原始生殖細胞的成功培養(yǎng),轉基因雞的制備主要使用慢病毒注射和雞原始生殖細胞轉移法這兩種方法,獲得的Go代轉基因雞外源基因的嵌合率高達52.2%。目前有細菌β-內酰胺酶,人類單克隆抗體和單鏈Fv-Fc融合蛋白等幾種重組蛋白成功地在轉基因雞蛋清中表達,本研究成功地利用慢病毒制備了在蛋清中表達重組人溶菌酶的轉基因雞。 溶菌酶(LY)又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶,廣泛存在于牛奶,唾液,哺乳動物淚水以及禽類蛋白中。雞溶菌酶(cLY)由129個氨基酸殘基組成,分子質量為14.3kDa,人溶菌酶(hLV)由130個氨基酸殘基組成,分子質量為14.7kDa,這兩種蛋白的組成氨基酸有59%的同源性。盡管這兩種溶菌酶的組成如此相近,人溶菌酶的抗菌活性卻是雞溶菌酶的三倍。人溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效,并且對人體完全無毒害、無副作用,是一種安全的抗感染物質和天然防腐劑,也是嬰兒食品、飲料的良好添加劑。然而,天然...

【文章頁數】：127 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
第一章 文獻綜述
    1.1 轉基因雞研究進展
        引言
        1.1.1 受精卵操作法
        1.1.2 利用胚胎干細胞制備嵌合體
        1.1.3 原始生殖細胞轉移法制備生殖系嵌合體
        1.1.4 利用病毒載體進行轉基因
    1.2 慢病毒載體研究進展
        引言
        1.2.1 慢病毒
        1.2.2 慢病毒載體
        1.2.3 慢病毒載體的發(fā)展歷程
        1.2.4 慢病毒假型化包膜的發(fā)展歷程
        1.2.5 慢病毒載體的制備
        1.2.6 慢病毒載體的應用
    1.3 溶菌酶研究簡介
        1.3.1 溶菌酶的分類
        1.3.2 重組人溶菌酶研究
    1.4 本研究的目的和技術路線
        1.4.1 研究目的
        1.4.2 技術路線
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質粒
        2.1.2 細胞系
        2.1.3 實驗雞蛋和種母雞
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 試劑的配制
        2.1.6 實驗儀器及耗材
        2.1.7 實驗分析軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 感受態(tài)細胞的制備
        2.2.2 感受態(tài)細胞的轉化
        2.2.3 DNA片段的連接
        2.2.4 質粒DNA的制備
        2.2.5 PCR產物與酶切產物的膠回收
        2.2.6 PCR反應
        2.2.7 菌落PCR法
        2.2.8 總RNA的提取(Trizol法)
        2.2.9 RNA的反轉錄
        2.2.10 HotSHOT提取DNA法
        2.2.11 DNA的提取
        2.2.12 Southern Blot
        2.2.13 細胞蛋白提取
        2.2.14 蛋白定量
        2.2.15 Western Blot
        2.2.16 細胞培養(yǎng)
        2.2.17 病毒包裝流程(Fugene HD轉染方法)
        2.2.18 病毒滴度測定
        2.2.19 Genome Walking
        2.2.20 ELISA測定人溶菌酶含量
        2.2.21 免疫熒光
        2.2.22 替代殼制備
        2.2.23 雞胚顯微注射(胚盤下腔注射)
        2.2.24 第一次換殼操作
        2.2.25 第二次換殼操作
        2.2.26 雞胚孵化
        2.2.27 雞的采精與輸精
第三章 G₀代嵌合體雞的制備和檢測
    引言
    3.1 載體構建
        3.1.1 載體構建的策略
        3.1.2 ERE和OV的克隆
        3.1.3 人工合成人溶菌酶cDNA序列
        3.1.4 慢病毒載體構建
    3.2 慢病毒包裝
        3.2.1 慢病毒制備
        3.2.2 慢病毒滴度測定
    3.3 雞胚注射及培養(yǎng)
        3.3.1 雞胚注射
        3.3.2 雞胚培養(yǎng)
        3.3.3 雞胚注射及培養(yǎng)結果
    3.4 G₀代雞外源基因檢測
        3.4.1 G₀代雞胚檢測
        3.4.2 G₀代育成期雞檢測
第四章 轉人溶菌酶雞的制備和檢測
    引言
    4.1 G₀代公雞精液外源基因檢測
    4.2 G₀代公雞的傳代
    4.3 G₁代轉基因雞鑒定
        4.3.1 PCR鑒定
        4.3.2 Southern Blot鑒定
        4.3.3 Genome Walking鑒定轉基因插入位點
    4.4 G₁代轉基因母雞蛋白檢測
    4.5 G₁代轉基因雞的傳代
    4.6 G₂代轉基因母雞蛋白檢測
    4.7 重組人溶菌酶在雞輸卵管特異性表達檢測
        4.7.1 RT-PCR檢測hLY的轉錄情況
        4.7.2 免疫熒光檢測hLY在雞輸卵管的表達情況
    4.8 討論
第五章 結論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3818201