發(fā)布時間：2023-05-14 08:05

　　牛結(jié)核病是一種主要由牛型分枝桿菌引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類疫病，其傳播流行影響著全球畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展及人類的健康。目前牛結(jié)核病臨床檢測的主要方法是PPD皮膚變態(tài)反應(yīng)，但是PPD與環(huán)境中其它分枝桿菌存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致檢測的特異性降低。ESAT6/CFP10是存在于致病性分枝桿菌中的優(yōu)勢抗原，其能引起動物感染早期的細胞免疫，但是在BCG疫苗株與禽結(jié)核分枝桿菌株中則沒有這種基因編碼，由此本研究選擇ESAT6/CFP10作為臨床診斷牛結(jié)核病的目的抗原以提高檢測的特異性。 以牛結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增得到目的基因，并克隆至pET32a(+)表達載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，隨后將其轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到45kd大小的蛋白。Western blot證實，重組蛋白具有良好的生物活性。Ni-NTA金屬離子親和層析得到純化的目的蛋白。利用ESAT6/CFP10與牛型提純結(jié)核菌素（PPD-B）對50頭假定健康奶牛進行臨床對比檢測，結(jié)果表明， ESAT6/CFP10組的陽性結(jié)果與PPD-B組的符合率為84.2%；利用ESAT6...

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
英文縮略詞
中文摘要
ABSTRACT
1 文獻綜述
    1.1 病原學(xué)綜述
        1.1.1 結(jié)核分枝桿菌的分類
        1.1.2 結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)特性
        1.1.3 結(jié)核分枝桿菌的基因組特點
    1.2 牛結(jié)核病綜述
        1.2.1 牛結(jié)核病的流行現(xiàn)狀
        1.2.2 牛結(jié)核病的危害
        1.2.3 牛結(jié)核病的發(fā)病及免疫機理
    1.3 牛結(jié)核病診斷技術(shù)綜述
        1.3.1 細菌學(xué)檢查方法
        1.3.2 免疫學(xué)檢測方法
        1.3.3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)
    1.4 ESAT6 與 CFP10 抗原綜述
        1.4.1 ESAT6 抗原與 CFP10 抗原的發(fā)現(xiàn)
        1.4.2 ESAT6 抗原與 CFP10 抗原的特質(zhì)
        1.4.3 ESAT6 與 CFP10 作為診斷抗原的研究進展
    1.5 研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要儀器及試劑
        2.1.3 試驗動物與細胞
    2.2 方法
        2.2.1 牛結(jié)核分枝桿菌 ESAT6/CFP10 融合基因的 PCR 擴增
        2.2.2 原核表達載體 pET-32a（+）-ESAT6/CFP10 的構(gòu)建及鑒定
        2.2.3 真核表達載體 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 的構(gòu)建及鑒定
        2.2.4 負載 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 基因的巨噬細胞的制備
        2.2.5 重組細菌的誘導(dǎo)表達及其產(chǎn)物的鑒定
        2.2.6 重組蛋白的 Western blot 分析
        2.2.7 重組蛋白的純化
        2.2.8 注射試劑的稀釋
        2.2.9 牛結(jié)核病皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗
        2.2.10 牛結(jié)核病 IFN-γ釋放試驗
        2.2.11 融合蛋白 ESAT6/CFP10 對 NR8383 增殖影響的測定
        2.2.12 融合蛋白 ESAT6/CFP10 對 NR8383 生成 NO 能力影響的測定
        2.2.13 數(shù)據(jù)分析與處理
3 結(jié)果與分析
    3.1 融合基因的 PCR 擴增結(jié)果
    3.2 重組原核質(zhì)粒 pET-32a（+）-ESAT6/CFP10 的鑒定
        3.2.1 pET32a（+）-ESAT6/CFP10 的雙酶切鑒定
        3.2.2 pET32a（+）-ESAT6/CFP10 的測序結(jié)果
    3.3 重組真核質(zhì)粒 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 的構(gòu)建及鑒定
        3.3.1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        3.3.2 重組質(zhì)粒的測序鑒定
    3.4 轉(zhuǎn)染試驗及轉(zhuǎn)染陽性 NR8383 巨噬細胞的檢測結(jié)果
    3.5 ESAT6/CFP10 蛋白在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達鑒定
        3.5.1 重組菌優(yōu)化表達的結(jié)果
        3.5.2 重組菌表達形式的分析結(jié)果
    3.6 重組蛋白 ESAT6/CFP10 的 Western blot 驗證結(jié)果
    3.7 重組蛋白 ESAT6/CFP10 的純化結(jié)果
    3.8 純化重組蛋白的濃度及純度測定
    3.9 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗的結(jié)果
        3.9.1 牛型 PPD 變態(tài)反應(yīng)的結(jié)果
        3.9.2 重組融合蛋白變態(tài)反應(yīng)的結(jié)果
    3.10 牛結(jié)核病 IFN-γ釋放試驗的結(jié)果
    3.11 融合蛋白 ESAT6/CFP10 對 NR8383 生長影響的測定
        3.11.1 ESAT6/CFP10 對未負載細胞增殖影響的結(jié)果
        3.11.2 ESAT6-CFP10 對負載細胞增殖影響的結(jié)果
    3.12 融合蛋白 ESAT6/CFP10 對 NR8383 生成 NO 能力影響的測定
4 討論
    4.1 目的基因的選取
    4.2 融合基因的構(gòu)建
    4.3 原核表達載體的選擇
    4.4 真核表達載體的選擇
    4.5 純化介質(zhì)的選擇
    4.6 融合蛋白在皮試中的敏感性與特異性
    4.7 重組蛋白在 IFN-γ ELISA 試驗中的表現(xiàn)
    4.8 重組蛋白在細胞試驗中的潛在作用
    4.9 試驗中可能存在的問題
        4.9.1 PPD 試驗中的測量時間
        4.9.2 病原的分離培養(yǎng)
參考文獻
附錄：常規(guī)試劑與培養(yǎng)基的配制
致謝



本文編號：3817497