腐敗梭菌(Clostridium septium)是人的氣性壞疽以及豬、馬、牛、羊、雞、鹿等多種動(dòng)物的惡性水腫病的主要病原,產(chǎn)生的α毒素(Clostridium septicum alpha toxin,CSA)是其分泌的幾種外毒素中最主要致死性毒力因子和免疫原,具有溶血活性,能夠?qū)е聶C(jī)體細(xì)胞壞死。腐敗梭菌感染羊引起羊快疫,發(fā)病羊病程多呈急性經(jīng)過(guò),發(fā)病后迅速死亡,病死率高,給我國(guó)畜牧業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是防治羊快疫的主要手段,由于缺乏體外抗體檢測(cè)方法。該類疫苗免疫后效果評(píng)價(jià)多采用血清-毒素中和后經(jīng)尾靜脈注射小鼠,根據(jù)小鼠死亡情況判定血清中和抗體效價(jià)的方法,該方法操作繁瑣,難以用于臨床大量樣本的免疫效果評(píng)價(jià)。為此,本研究擬通過(guò)制備腐敗梭菌α毒素單克隆抗體,建立腐敗梭菌α毒素阻斷ELISA檢測(cè)方法,以期用快速、簡(jiǎn)便、高通量的體外檢測(cè)方法替代動(dòng)物檢驗(yàn)法,用于疫苗的效力檢驗(yàn)及疫苗免疫后效果評(píng)價(jià)。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng),通過(guò)缺失腐敗梭菌α毒素的第212²22位共11個(gè)氨基酸序列,使其喪失毒力,對(duì)腐敗梭菌重組α毒素?zé)o毒突變體進(jìn)行體外表達(dá),目的蛋白主要以可溶性形式表達(dá)。...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 引言
    1.1 梭菌屬概述
        1.1.1 梭菌屬生物特性
        1.1.2 主要致病性梭菌概述
    1.2 腐敗梭菌研究進(jìn)展
        1.2.1 病原學(xué)
        1.2.2 流行病學(xué)
        1.2.3 臨床癥狀
        1.2.4 病理變化
        1.2.5 致病機(jī)理
        1.2.6 診斷
        1.2.7 防治
    1.3 腐敗梭菌α毒素
        1.3.1 α毒素的理化特性及生物學(xué)特性
        1.3.2 α毒素的結(jié)構(gòu)與功能
        1.3.3 α毒素的免疫原性
    1.4 本研究的目的與意義
第二章 腐敗梭菌α毒素制備
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 菌株
        2.2.2 主要試劑與耗材
    2.3 方法
        2.3.1 腐敗梭菌天然α毒素制備
        2.3.2 重組腐敗梭菌α毒素?zé)o毒突變體制備
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 腐敗梭菌天然α毒素制備
        2.4.2 重組腐敗梭菌α毒素?zé)o毒突變體制備
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三章 單克隆抗體的制備與鑒定
    3.1 前言
    3.2 材料
        3.2.1 菌株
        3.2.2 主要試劑與耗材
    3.3 方法
        3.3.1 小鼠免疫
        3.3.2 細(xì)胞融合
        3.3.3 單克隆抗體篩選
        3.3.4 單克隆抗體亞型鑒定
        3.3.5 單克隆抗體針對(duì)抗原表位鑒定
        3.3.6 細(xì)胞中和試驗(yàn)
        3.3.7 單克隆抗體的大量制備
        3.3.8 單克隆抗體的純化及效價(jià)測(cè)定
        3.3.9 單克隆抗體特異性鑒定
        3.3.10 單克隆抗體親和常數(shù)測(cè)定
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 小鼠免疫
        3.4.2 細(xì)胞融合
        3.4.3 陽(yáng)性雜交瘤孔的克隆
        3.4.4 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        3.4.5 單克隆抗體亞型鑒定
        3.4.6 單克隆抗體針對(duì)抗原表位鑒定
        3.4.7 中和試驗(yàn)
        3.4.8 腹水制備
        3.4.9 單克隆抗體純化效果鑒定
        3.4.10 單克隆抗體特異性鑒定
        3.4.11 單克隆抗體親和常數(shù)測(cè)定結(jié)果
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
第四章 阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立
    4.1 前言
    4.2 材料
        4.2.1 菌株
        4.2.2 主要試劑與耗材
    4.3 方法
        4.3.1 制備包被抗原
        4.3.2 阻斷ELISA基本操作步驟
        4.3.3 最佳抗原包被濃度以及陰、陽(yáng)性血清工作濃度的確定
        4.3.4 單抗以及酶標(biāo)抗體工作濃度的確定
        4.3.5 包被液以及包被條件的確定
        4.3.6 封閉液以及封閉條件的確定
        4.3.7 單克隆抗體作用條件的確定
        4.3.8 底物顯色液作用條件的確定
        4.3.9 陰陽(yáng)性臨界值的確定
        4.3.10 特異性試驗(yàn)
        4.3.11 重復(fù)性試驗(yàn)
        4.3.12 阻斷ELISA與細(xì)胞中和試驗(yàn)相關(guān)性測(cè)定
        4.3.13 阻斷ELISA與小鼠中和試驗(yàn)相關(guān)性測(cè)定
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 最佳抗原包被濃度以及陰、陽(yáng)性血清工作濃度的確定
        4.4.2 單抗及酶標(biāo)抗體工作條件的確定
        4.4.3 包被液以及包被條件的確定
        4.4.4 封閉液以及封閉條件的確定
        4.4.5 單抗作用條件的確定
        4.4.6 底物顯色液作用條件的確定
        4.4.7 陰、陽(yáng)性臨界值的確定
        4.4.8 特異性試驗(yàn)
        4.4.9 重復(fù)性試驗(yàn)
        4.4.10 阻斷ELISA與細(xì)胞中和試驗(yàn)相關(guān)性
        4.4.11 阻斷ELISA與小鼠中和試驗(yàn)相關(guān)性
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
第五章 結(jié)論
第六章 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3817317