豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)被公認為是嚴重危害全世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原,其感染可以引起多種圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCV2-associated diseases,PCVD),包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征和母豬繁殖障礙綜合征等疾病,導致巨大經(jīng)濟損失。PCV2是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒,是目前已知的最小的動物病毒之一,其感染的靶細胞主要是巨噬細胞、樹突狀細胞和淋巴細胞等多種免疫細胞,因此PCV2感染還可導致動物機體發(fā)生嚴重的免疫抑制。另外,PCV2感染還可促進多種病原的共感染。雖然疫苗免疫可顯著降低PCV2相關(guān)疾病的發(fā)生,但卻不能清除PCV2的感染。研究顯示PCV2在養(yǎng)豬業(yè)中感染率可高達60%以上。然而,目前對于PCV2的感染和致病的詳細機制尚不完全清楚。衣殼蛋白(Capsid protein,Cap)是PCV2主要的抗原蛋白,含有病毒的主要抗原決定簇,在病毒的識別和入侵過程中起重要作用。制備抗Cap抗體是研究PCV2致病機制的有利工具之一。但PCV2 ORF2全長在大腸桿菌中表達量低且多為包涵體形式存在,限制了Cap蛋...

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【學位級別】：碩士

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1 前言
    1.1 豬圓環(huán)病毒的流行現(xiàn)狀與防控
    1.2 PCV2 的分子生物學特征
        1.2.1 豬圓環(huán)病毒的結(jié)構(gòu)和特征
        1.2.2 豬圓環(huán)病毒主要開放閱讀框及其編碼蛋白
        1.2.3 豬圓環(huán)病毒的復制
    1.3 豬圓環(huán)病毒的檢測
        1.3.1 病毒分離
        1.3.2 PCR檢測方法
        1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測(ELISA)
        1.3.4 間接免疫熒光法檢測(IFA)
        1.3.5 間接免疫組化法檢測(IHC)
    1.4 圓環(huán)病毒抗體的研究進展
    1.5 本研究目的意義
2 材料與方法
    2.1 主要儀器設(shè)備
    2.2 實驗材料
    2.3 實驗方法
        2.3.1 PCV2 Cap蛋白氨基酸序列分析與目的基因擴增
        2.3.2 DNA瓊脂糖凝膠純化與回收
        2.3.3 感受態(tài)細胞的制備
        2.3.4 重組表達載體構(gòu)建與鑒定
        2.3.5 重組質(zhì)粒的小量提取
        2.3.6 重組蛋白的誘導表達
        2.3.7 SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色
        2.3.8 免疫印跡
        2.3.9 重組蛋白的誘導表達及表達條件優(yōu)化
        2.3.10 重組蛋白的純化
        2.3.11 蛋白濃度測定
        2.3.12 純化蛋白的透析濃縮
        2.3.13 實驗動物免疫與血清采集
        2.3.14 酶聯(lián)免疫吸附實驗
        2.3.15 辛酸-硫酸銨沉淀法純化血清
        2.3.16 細胞的培養(yǎng)、復蘇以及凍存
        2.3.17 PCV2 病毒感染的細胞和動物模型
        2.3.18 細胞間接免疫熒光
        2.3.19 組織切片與免疫組織化學分析
        2.3.20 PCV2 臨床毒株的分離與鑒定
3 結(jié)果與分析
    3.1 PCV2 Cap蛋白原核表達載體的構(gòu)建與鑒定
    3.2 Cap蛋白的可溶性誘導表達及條件優(yōu)化
    3.3 重組蛋白的純化及檢測
    3.4 多克隆抗血清效價的檢測
    3.5 抗血清特異性檢測
    3.6 抗血清的純化與特異性檢測
    3.7 應(yīng)用抗Cap多克隆抗體進行間接免疫熒光和免疫組化檢測
    3.8 抗Cap多克隆抗體的臨床應(yīng)用
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3811792