豬是流感病毒發(fā)生重配的“混合器”以及產(chǎn)生流感病毒新毒株的“孵育器”,因而豬在流感病毒種間傳播中扮演重要角色,因此防止流感病毒在豬群中的傳播具有很重要的公共衛(wèi)生意義。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御外界病原感染的非特異性防御系統(tǒng),宿主是否發(fā)病取決于病原感染和機(jī)體防御相互作用的結(jié)果,防御能力較強(qiáng)的豬便表現(xiàn)出天然的抗病力。因此,從遺傳本質(zhì)上提高豬對(duì)豬流感等病毒的抗病能力,篩選和培育具有抗流感病毒的動(dòng)物品系,是防控流感病毒的治本之策。而獲得有效的抗病候選基因是開(kāi)展抗病育種工作的重中之重。同時(shí),流感病毒為了有效的感染宿主會(huì)采取各種策略拮抗宿主的抗病毒防御應(yīng)答,尤其是干擾素介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答。熱休克蛋白27(HSP27)是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的小熱休克蛋白。病毒感染宿主細(xì)胞幾乎都會(huì)誘導(dǎo)HSP27的高度表達(dá),但是其在病毒感染中的作用仍不清楚。同時(shí),有研究表明,HSP27能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,包括NF-κB介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答通路,但其在宿主干擾素信號(hào)通路中的功能尚不清楚。因此,本研究首先以豬轉(zhuǎn)錄組芯片-生物信息學(xué)為平臺(tái)初步篩選流感病毒感染豬誘導(dǎo)表達(dá)的基因,通過(guò)過(guò)表達(dá)和沉默技術(shù)檢測(cè)這些基因?qū)α鞲胁《驹鲋车挠绊?...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1 豬流感
        1.1 北美豬流感病毒
        1.2 歐亞豬流感病毒
        1.3 甲型H1N1豬流感病毒
        1.4 豬與禽流感病毒
    2 高通量篩選病毒感染相關(guān)宿主基因技術(shù)
        2.1 蛋白互作技術(shù)
        2.2 基因組學(xué)
        2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)
        2.4 RNAi
    3 天然免疫系統(tǒng)
        3.1 模式識(shí)別受體
        3.2 TLRs
        3.3 RLRs
        3.4 干擾素
        3.5 JAK-STAT通路
        3.6 干擾素誘導(dǎo)基因
    4 流感病毒誘導(dǎo)的信號(hào)通路
    5 干擾素負(fù)調(diào)控機(jī)制
        5.1 降解主要的接頭分子
        5.2 對(duì)接頭分子進(jìn)行蛋白修飾
        5.3 阻斷接頭分子的互作
        5.4 流感病毒拮抗干擾素通路的策略
            5.4.1 通過(guò)病毒蛋白拮抗干擾素
            5.4.2 通過(guò)宿主蛋白拮抗干擾素
    6 熱休克蛋白
        6.1 HSP60
        6.2 HSP70
        6.3 HSP90
        6.4 sHSPs
    7 HSP27功能介紹
        7.1 HSP27抗凋亡功能
        7.2 HSP27與免疫應(yīng)答
        7.3 HSP27與病毒感染
第2章 目的與意義
第3章 材料與方法
    1 材料
        1.1 細(xì)菌、細(xì)胞和病毒
        1.2 質(zhì)粒
            1.2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒
            1.2.2 啟動(dòng)子相關(guān)質(zhì)粒
            1.2.3 克隆質(zhì)粒
            1.2.4 RNAi質(zhì)粒
            1.2.5 細(xì)胞定位質(zhì)粒
            1.2.6 泛素化相關(guān)質(zhì)粒
        1.3 抗體
        1.4 siRNA
        1.5 主要試劑
        1.6 重要儀器和設(shè)備
    2 主要方法
        2.1 DNA實(shí)驗(yàn)
            2.1.1 基因克隆
            2.1.2 DNA回收和質(zhì)粒抽提
            2.1.3 基因組DNA提取
            2.1.4 基因突變技術(shù)
        2.2 RNA實(shí)驗(yàn)
            2.2.1 TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA
            2.2.2 RT-PCR
            2.2.3 熒光定量PCR
        2.3 蛋白實(shí)驗(yàn)
            2.3.1 細(xì)胞蛋白抽提及濃度測(cè)定
            2.3.2 熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
            2.3.3 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)步驟
            2.3.4 蛋白的泛素化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
            2.3.5 SDS-PAGE電泳
            2.3.6 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜
            2.3.7 Western Blot實(shí)驗(yàn)
            2.3.8 GTP酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)
            2.3.9 流感病毒聚合酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)
        2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
            2.4.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
            2.4.2 siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
            2.4.3 間接免疫熒光
            2.4.4 蛋白亞細(xì)胞定位觀(guān)察
            2.4.5 TCID50的測(cè)定
            2.4.6 空斑法檢測(cè)病毒含量
        2.5 肺組織病理切片制作
        2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
第4章 結(jié)果與討論
    1 抗流感病毒基因的篩選與功能驗(yàn)證
        1.1 豬H1N1流感病毒感染模型建立
            1.1.1 臨床癥狀
            1.1.2 病理變化
        1.2 豬H1N1流感病毒感染肺組織芯片
            1.2.1 肺組織RNA樣品檢測(cè)
            1.2.2 芯片分析
                1.2.2.1 聚類(lèi)分析
                1.2.2.2 GO分析
                1.2.2.3 主要的差異表達(dá)基因
                1.2.2.4 差異基因Pathway分析
            1.2.3 芯片結(jié)果RT-PCR驗(yàn)證
            1.2.4 RT-PCR檢測(cè)豬肺組織ISGs表達(dá)變化
        1.3 肺組織差異基因抗病毒功能
            1.3.1 干擾素誘導(dǎo)基因?qū)1N1病毒增殖的影響
            1.3.2 干擾素誘導(dǎo)基因?qū)5N1病毒增殖的影響
            1.3.3 豬宿主防御肽對(duì)H5N1病毒增殖影響
            1.3.4 豬干擾素啟動(dòng)子活性檢測(cè)
            1.3.5 干擾素誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)對(duì)干擾素啟動(dòng)子影響
        1.4 IRF1抗病毒機(jī)制研究
            1.4.1 IRF1過(guò)表達(dá)對(duì)H5N1病毒復(fù)制的影響
            1.4.2 IRF1過(guò)表達(dá)對(duì)VSV復(fù)制的影響
            1.4.3 IRF1過(guò)表達(dá)對(duì)干擾素信號(hào)通路影響
        1.5 GBP1抗病毒機(jī)制研究
            1.5.1 GBP1過(guò)表達(dá)對(duì)流感病毒增殖的影響
                1.5.1.1 GBP1抑制各種亞型豬流感病毒的復(fù)制
                1.5.1.2 GBP1對(duì)H5N1流感病毒不同形式RNA的影響
            1.5.2 敲除GBP1對(duì)流感病毒增殖的影響
            1.5.3 GTP結(jié)合位點(diǎn)與抗病毒有關(guān)
                1.5.3.1 GBP1抗病毒結(jié)構(gòu)域確定
                1.5.3.2 GTP結(jié)合位點(diǎn)突變后對(duì)病毒增殖影響
                1.5.3.3 GBP1的GTPase酶活性測(cè)定
            1.5.4 GBP1對(duì)干擾素信號(hào)通路通路的影響
            1.5.5 GBP1抑制流感病毒聚合酶活力
            1.5.6 GBP1與NP蛋白互作
            1.5.7 GBP1與NP在細(xì)胞核周?chē)捕ㄎ?br>        1.6 討論
        1.7 小結(jié)
    2 HSP27拮抗宿主干擾素信號(hào)通路研究
        2.1 H5N1感染人的A549細(xì)胞后總蛋白表達(dá)變化
        2.2 H5N1感染人的A549細(xì)胞后HSP27蛋白表達(dá)變化
        2.3 其他RNA病毒感染細(xì)胞后HSP27變化
        2.4 HSP27定點(diǎn)突變與表達(dá)
        2.5 HSP27過(guò)表達(dá)對(duì)H5N1增殖影響
        2.6 HSP27過(guò)表達(dá)對(duì)VSV病毒增殖的影響
        2.7 HSP27沉默對(duì)VSV增殖的影響
        2.8 HSP27過(guò)表達(dá)對(duì)干擾素等啟動(dòng)子影響
        2.9 HSP27過(guò)表達(dá)抑制VISA和TRIF介導(dǎo)的抗病毒作用以及IRF3磷酸化
        2.10 HSP27沉默對(duì)干擾素等啟動(dòng)子影響
        2.11 HSP27與IFN-β通路接頭分子互作
        2.12 HSP27對(duì)VISA、TRAF3和TRAF6表達(dá)影響
        2.13 HSP27影響接頭分子泛素化
        2.14 HSP27通過(guò)K48泛素化方式降解TRAF3和TRAF6
        2.15 HSP27不改變TRAF3和TRAF6的K63泛素化
        2.16 HSP27定位于線(xiàn)粒體
        2.17 HSP27磷酸化抑制劑對(duì)VSV-GFP病毒增殖影響
        2.18 HSP27磷酸化對(duì)干擾素啟動(dòng)子活性以及H5N1病毒CPE影響
        2.19 HSP27磷酸化位點(diǎn)突變體與VISA互作研究
        2.20 討論
        2.21 小結(jié)
第5章 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷
發(fā)表的主要論文
致謝



本文編號(hào)：3810844