脂多糖(LPS)是引起炎癥的刺激源之一,常用于建立炎癥模型。前期研究發(fā)現5μg/mL的LPS刺激6 h能引起小鼠乳腺上皮細胞(MECs)生長活性及炎性因子分泌發(fā)生變化,LPS早期刺激炎癥信號通路尚不清楚。為了探明LPS早期刺激MECs免疫炎性關鍵基因及金英黃歸湯(簡稱金英湯,JYT)對其影響,本研究采用ELISA檢測5μg/mL的LPS刺激細胞6 h細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌量驗證細胞早期炎癥反應,運用轉錄組測序技術(RNA-seq)檢測LPS刺激細胞后的差異基因,進行GO和KEGG Pathway分析篩選與炎癥免疫相關基因,并用實時熒光定量PCR(qPCR)驗證部分差異基因相關性,通過siRNA轉染技術沉默差異基因中Cxcl1、Ccl2研究其在LPS信號通路中關鍵靶向,并運用qPCR檢測金英湯對Cxcl1、Csf2、Csf3、Ccl2、Met、Birc3、Icam1和Cav1 mRNA的影響。結果顯示:(1)5μg/mL的LPS刺激小鼠MECs 6 h,細胞分泌的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6都顯著或極顯著的升高(P<0.05,P<0...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
1 材料
    1.1 實驗動物
    1.2 主要藥物及試劑
    1.3 主要溶液配制
    1.4 主要實驗儀器
2 方法
    2.1 ELISA法檢測LPS致小鼠MECs分泌的炎性因子
    2.2 RNA-seq篩選LPS作用小鼠MECs前后差異表達基因
        2.2.1 細胞總RNA提取及質檢
        2.2.2 RNA-seq檢測
        2.2.3 上調差異基因數據分析
    2.3 GO和Pathway分析篩選與炎癥免疫相關的基因
    2.4 部分差異表達基因的qPCR驗證
    2.5 Cxcl1和Ccl2在小鼠MECsLPS炎癥免疫信號通路中作用地位的分析
        2.5.1 轉染片段設計及最佳轉染條件篩選
        2.5.2 實時熒光定量PCR檢測Cxcl1、Ccl2沉默后對LPS信號通路中NF-κBp65的影響
        2.5.3 ELISA法檢測Cxcl1、Ccl2沉默后對LPS致細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的影響
    2.6 實時熒光定量PCR檢測金英湯對Cxcl1、Csf2、Csf3、Ccl2、Met、Birc3、Icam1、Cav1mRNA的影響
    2.7 統計學處理
3 結果
    3.1 LPS對MECs分泌炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的影響
    3.2 LPS刺激后小鼠MECs差異表達基因
        3.2.1 RNA提取及質檢結果
        3.2.2 轉錄組測序分析結果
    3.3 小鼠MECs與炎癥免疫相關的差異表達基因
        3.3.1 基因功能及GO分析
        3.3.2 LPS信號通路相關Pathway分析
        3.3.3 部分差異表達基因的RT-qPCR驗證
    3.4 Cxcl1、Ccl2在LPS炎癥信號通路中的作用地位
        3.4.1 Cxcl1、Ccl2的siRNA最佳轉染條件
        3.4.2 Cxcl1、Ccl2基因沉默后對LPS信號通路中NF-κBp65的影響
        3.4.3 Cxcl1、Ccl2基因沉默后對LPS致細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-及IL-1β量的影響
    3.5 金英湯對MECs中8個差異基因的影響
4 討論
    4.1 LPS刺激小鼠MECs建立炎癥模型
    4.2 LPS刺激后小鼠MECs中差異表達基因
    4.3 小鼠MECs中與LPS信號通路相關的上調差異基因
    4.4 Cxcl1、Ccl2與LPS信號通路的關系
    4.5 金英湯對LPS信號通路相關因子的影響
5 結論
文獻綜述
    1 炎癥與LPS及其信號通路
        1.1 炎癥的概述
        1.2 LPS概述
        1.3 LPS信號通路
    2 RNA-seq研究進展
        2.1 轉錄組測序基礎分析示意圖
        2.2 測序基礎分析方法
        2.3 RNA-seq在轉錄組學中的優(yōu)勢
        2.4 轉錄組技術的應用
            2.4.1 基因功能注釋及獲取新轉錄本
            2.4.2 進行基因轉錄水平研究
            2.4.3 非轉錄RNA功能研究
            2.4.4 轉錄本結構變異研究
            2.4.5 分子標記的開發(fā)
            2.4.6 新基因的挖掘及其功能預測
        2.5 RNA-seq的研究展望
    3 Cxcl1和Ccl2的生物學特性及功能
        3.1 Cxcl1的生物學特性及功能
        3.2 Ccl2的生物學特性及功能
    4 siRNA研究進展
        4.1 siRNA的作用機制
        4.2 siRNA技術的特征
        4.3 siRNA的應用
    5 中藥的抗炎免疫及其機制研究
參考文獻
附錄一 在讀碩士期間發(fā)表論文情況
附錄二 在讀期間參與的科研項目
致謝



本文編號：3807914