p-乳球蛋白(BLG)是牛奶中的主要蛋白,要占到乳清蛋白總量的一半以上,被認(rèn)為是導(dǎo)致乳過(guò)敏癥的過(guò)敏原。降低羊奶中的β-乳球蛋白含量,能使羊乳在食品工業(yè)中得到更廣泛的應(yīng)用。而經(jīng)典的生化手段在去除羊乳中的p-乳球蛋白過(guò)程繁雜、副產(chǎn)物多、成本較高,不易推廣使用。因此利用分子育種手段生產(chǎn)BLG基因敲除奶山羊?qū)榻鉀Q這一問(wèn)題帶來(lái)希望。 鋅指核酸酶(ZFN)技術(shù)可以針對(duì)設(shè)計(jì)好的基因組靶序列高效、安全地進(jìn)行修飾,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。模塊拼裝是一個(gè)快速,便捷,開(kāi)放源碼的鋅指核酸酶合成方法。然而,這阻礙了多步建設(shè),低效率的編輯和脫靶裂解生物技術(shù)。BLG是唯一一個(gè)被成功修飾的反芻動(dòng)物基因,打靶的ZFNs由Sigma-Aldrich公司合成。 在本研究中,利用重疊PCR法優(yōu)化建立了一套快速、便捷、高效的模塊拼裝鋅指核酸酶構(gòu)建法。利用這套優(yōu)化體系,設(shè)計(jì)并合成了6對(duì)靶向山羊BLG基因第一外顯子的鋅指核酸酶組合。在設(shè)計(jì)鋅指核酸酶的同時(shí),我們還利用分子建模的方法對(duì)設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶蛋白結(jié)構(gòu)以及靶片段結(jié)合效果進(jìn)行預(yù)測(cè)并進(jìn)行評(píng)估,預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較,以期提供一種預(yù)測(cè)人工構(gòu)建蛋白功能以及合成預(yù)篩選的方法。 構(gòu)建好的鋅指...

【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
縮略詞
引言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 山羊β-乳球蛋白與BLG基因研究概況
        1.1 β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.2 β乳球蛋白的致敏性,對(duì)其傳統(tǒng)的理化消除方法及局限性
        1.3 BLG基因的結(jié)構(gòu)
        1.4 分子育種方法消除β-乳球蛋白影響的嘗試
    2 鋅指核酸酶研究概況
        2.1 鋅指結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)
        2.2 鋅指核酸酶的結(jié)構(gòu)與作用原理
        2.3 鋅指核酸酶的構(gòu)建過(guò)程
        2.4 鋅指核酸酶在動(dòng)物基因組修飾中的應(yīng)用
    3 本研究的目的與意義
第二章 鋅指核酸酶的構(gòu)建與模塊拼裝法的技術(shù)優(yōu)化
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 菌株與質(zhì)粒
        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.3 主要儀器及實(shí)驗(yàn)器械
        1.4 網(wǎng)絡(luò)資源及軟件
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 重疊PCR構(gòu)建鋅指模塊
        2.2 鋅指模塊與非特異性核酸酶的拼裝
        2.3 轉(zhuǎn)化
        2.4 陽(yáng)性克隆的鑒定
        2.5 質(zhì)粒提取
        2.6 鋅指核酸酶的分子建模模擬
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 鋅指模塊的設(shè)計(jì)
        3.2 重疊PCR構(gòu)建鋅指模塊
        3.3 鋅指核酸酶的構(gòu)建
        3.4 鋅指核酸酶的分子建模與打靶效率預(yù)測(cè)
    4 討論
第三章 鋅指核酸酶在山羊成纖維細(xì)胞中敲除BLG基因的研究
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 細(xì)胞及其來(lái)源
        1.2 網(wǎng)絡(luò)資源及軟件
        1.3 主要試劑
        1.4 儀器設(shè)備
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2 鋅指核酸酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
        2.3 轉(zhuǎn)染效率統(tǒng)計(jì)
            2.3.1 DAPI染色與細(xì)胞觀察
            2.3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)
        2.4 細(xì)胞基因組提取
        2.5 靶目標(biāo)片段的擴(kuò)增
        2.6 靶片段的突變檢測(cè)
        2.7 鋅指核酸酶的體外轉(zhuǎn)錄
    3 結(jié)果
        3.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化以及鋅指核酸酶轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞
        3.3 鋅指核酸酶介導(dǎo)的細(xì)胞突變檢測(cè)
        3.4 鋅指核酸酶的體外轉(zhuǎn)錄
    4 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3800693