通城豬(TC)和大白豬(YK)是兩個具有獨特肌肉特點的豬品種。在本研究中,首先,通過Solexa測序研究了通城豬和大白豬胎兒期40天、55天、63天、70和90天五個發(fā)育階段背最長肌中miRNA的表達情況,篩選兩豬種中調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育的差異表達miRNA。其次,聯(lián)合同一批樣品檢測得到的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),對miRNA進行深度分析,并對挖掘到的差異表達miRNA-差異表達蛋白進行靶基因驗證。最后,對miR-499-5p在肌肉細胞中的功能進行研究。主要研究結(jié)果如下:1.共對比注釋得到320個豬已知miRNA、64個其他哺乳動物已知miRNA以及224個預測的新miRNA。主成分分析和層次聚類分析表明,豬品種間miRNA的表達差異小于發(fā)育階段miRNA的表達差異。通城豬不同發(fā)育階段中差異表達miRNA合計共有57個,大白豬合計共有45個,隨肌肉發(fā)育進程表達水平逐步下降的差異表達miRNA占大多數(shù)。通城豬、大白豬相同發(fā)育時間點的差異表達miRNA分別有23、30、12、6、30個,主要與蛋白修飾、蛋白轉(zhuǎn)運和代謝過程相關(guān)。miR-499-5p表達量高,同時是不同發(fā)育階段差異表達miRNA,且是唯一...

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
縮略表(Abbreviation)
第一章 前言
    1.通城豬與大白豬
    2.豬骨骼肌發(fā)育
        2.1 .豬骨骼肌發(fā)育的時間節(jié)點
        2.2 .豬骨骼肌肌纖維類型
    3.骨骼肌發(fā)育中的肌動蛋白重塑
        3.1 .骨骼肌發(fā)育的主要調(diào)控因子
        3.2 .骨骼肌發(fā)育中調(diào)控因子的時序表達
        3.3 .肌細胞融合需要重構(gòu)肌動蛋白
        3.4 .ADF家族在肌動蛋白重構(gòu)中發(fā)揮重要作用
    4.骨骼肌發(fā)育相關(guān)miRNA
        4.1 .miRNA的調(diào)控機制
        4.2 .骨骼肌發(fā)育中的miRNA
        4.3 .miR-499-5p促進慢肌纖維形成
    5.豬肌肉miRNA組學及關(guān)聯(lián)分析研究進展
        5.1 .豬肌肉miRNA組學研究進展
        5.2 .豬肌肉聯(lián)合多組學分析miRNA的研究進展
        5.3 .其他物種的多組學關(guān)聯(lián)分析研究
    6.目的與意義
第二章 豬miRNA文庫構(gòu)建及高通量測序分析
    1.前言
    2.試驗材料
        2.1 .試驗動物
        2.2 .主要儀器和設(shè)備
        2.3 .主要試劑
        2.4 .常用試劑配制
        2.5 .生物信息學分析
        2.6 .生物技術(shù)服務
    3.試驗方法
        3.1 .RNA提取與質(zhì)量檢測
            3.1.1 .RNA提取
            3.1.2 .RNA質(zhì)量檢測
        3.2 .建立文庫及測序
        3.3 .測序結(jié)果注釋
            3.3.1 .測序數(shù)據(jù)過濾
            3.3.2 .比對與注釋
            3.3.3 .miRNA表達量的計算
        3.4 .聚類分析
            3.4.1 .主成分分析
            3.4.2 .熱圖聚類分析
        3.5 .功能富集分析
            3.5.1 .靶基因預測
            3.5.2 .GO功能富集分析
            3.5.3 .KEGG通路富集分析
        3.6 .miRNA時序性表達分析
        3.7 .差異分析
        3.8 .實時熒光定量PCR
            3.8.1 .RNA反轉(zhuǎn)錄
            3.8.2 .引物設(shè)計及退火溫度的確定
            3.8.3 .實時熒光定量
    4.結(jié)果與分析
        4.1 .原始數(shù)據(jù)
            4.1.1 .文庫的建立
            4.1.2 .測序原始數(shù)據(jù)
        4.2 .miRNA特征分析
            4.2.1 .長度分布
            4.2.2 .基因組定位
            4.2.3 .注釋分類
        4.3 .miRNA分類及靶基因預測
            4.3.1 .miRNA分類
            4.3.2 .miRNA靶基因預測
        4.4 .miRNA表達量及高表達miRNA的功能富集分析
        4.5 .聚類分析
            4.5.1 .PCA聚類
            4.5.2 .熱圖聚類
        4.6 .miRNA時序性表達分析及功能注釋
        4.7 .差異表達miRNA及功能注釋
            4.7.1 .不同發(fā)育階段差異表達miRNA分析
            4.7.2 .品種間差異表達miRNA分析
        4.8 .測序數(shù)據(jù)的實時熒光定量PCR驗證
    5.討論
第三章 miRNA組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的整合分析及驗證
    1.前言
    2.試驗材料
        2.1 .載體、菌株、細胞
        2.2 .主要儀器和設(shè)備
        2.3 .主要試劑耗材
        2.4 .常用試劑配制
        2.5 .數(shù)據(jù)庫與分析軟件
        2.6 .生物技術(shù)服務
    3.試驗方法
        3.1 .miRNA與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
            3.1.1 .篩選差異差異miRNA-差異表達靶基因?qū)?br>        3.2 .網(wǎng)絡互作分析及繪圖
        3.3 .轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        3.4 .功能富集分析
        3.5 .miRNA與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        3.6 .靶基因3’UTR雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建
            3.6.1 .引物設(shè)計
            3.6.2 .T 載體質(zhì)粒構(gòu)建
            3.6.3 .雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建
            3.6.4 .突變型雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建
        3.7 .細胞培養(yǎng)
        3.8 .細胞轉(zhuǎn)染
        3.9 .雙熒光素酶活性的測定
    4.結(jié)果與分析
        4.1 .miRNA與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
            4.1.1 .不同發(fā)育階段miRNA與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
            4.1.2 .不同品種miRNA與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
        4.2 .轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        4.3 .miRNA與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        4.4 .三對豬miRNA與靶基因驗證
        4.5 .三對小鼠miRNA與靶基因驗證
    5.討論
第四章 miR-499-5p的功能驗證
    1.前言
    2.試驗材料
        2.1 .細胞
        2.2 .主要儀器和設(shè)備
        2.3 .主要試劑耗材
        2.4 .常用試劑配制
        2.5 .數(shù)據(jù)庫與分析軟件
        2.6 .生物技術(shù)服務
    3.試驗方法
        3.1 .細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        3.2 .RNA提取與質(zhì)量檢測
        3.3 .實時熒光定量PCR
            3.3.1 .莖環(huán)引物法RNA反轉(zhuǎn)錄
            3.3.2 .莖環(huán)引物設(shè)計及退火溫度的確定
            3.3.3 .實時熒光定量
        3.4 .免疫熒光檢測
        3.5 .細胞周期檢測
        3.6 .細胞遷移檢測
        3.7 .細胞凋亡檢測
    4.結(jié)果與分析
        4.1 .miR-499-5p轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控DSTN
            4.1.1 .miR-499-5p不影響DSTN的 mRNA水平
            4.1.2 .miR-499-5p抑制DSTN蛋白表達
        4.2 .miR-499-5p促進細胞遷移
        4.3 .miR-499-5p提高G0、G1 期細胞比例
        4.4 .分化的啟動不能缺少miR-499-5p
        4.5 .miR-499-5p表達水平異常促進細胞凋亡
    5.討論
第五章 總結(jié)
    1.本研究的主要結(jié)論與創(chuàng)新點
    2.本研究的不足之處與后續(xù)研究建議
參考文獻
在讀期間發(fā)表論文情況
致謝



本文編號：3793474