通城豬(TC)和大白豬(YK)是兩個(gè)具有獨(dú)特肌肉特點(diǎn)的豬品種。在本研究中,首先,通過Solexa測(cè)序研究了通城豬和大白豬胎兒期40天、55天、63天、70和90天五個(gè)發(fā)育階段背最長肌中miRNA的表達(dá)情況,篩選兩豬種中調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育的差異表達(dá)miRNA。其次,聯(lián)合同一批樣品檢測(cè)得到的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),對(duì)miRNA進(jìn)行深度分析,并對(duì)挖掘到的差異表達(dá)miRNA-差異表達(dá)蛋白進(jìn)行靶基因驗(yàn)證。最后,對(duì)miR-499-5p在肌肉細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:1.共對(duì)比注釋得到320個(gè)豬已知miRNA、64個(gè)其他哺乳動(dòng)物已知miRNA以及224個(gè)預(yù)測(cè)的新miRNA。主成分分析和層次聚類分析表明,豬品種間miRNA的表達(dá)差異小于發(fā)育階段miRNA的表達(dá)差異。通城豬不同發(fā)育階段中差異表達(dá)miRNA合計(jì)共有57個(gè),大白豬合計(jì)共有45個(gè),隨肌肉發(fā)育進(jìn)程表達(dá)水平逐步下降的差異表達(dá)miRNA占大多數(shù)。通城豬、大白豬相同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)miRNA分別有23、30、12、6、30個(gè),主要與蛋白修飾、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程相關(guān)。miR-499-5p表達(dá)量高,同時(shí)是不同發(fā)育階段差異表達(dá)miRNA,且是唯一...

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表(Abbreviation)
第一章 前言
    1.通城豬與大白豬
    2.豬骨骼肌發(fā)育
        2.1 .豬骨骼肌發(fā)育的時(shí)間節(jié)點(diǎn)
        2.2 .豬骨骼肌肌纖維類型
    3.骨骼肌發(fā)育中的肌動(dòng)蛋白重塑
        3.1 .骨骼肌發(fā)育的主要調(diào)控因子
        3.2 .骨骼肌發(fā)育中調(diào)控因子的時(shí)序表達(dá)
        3.3 .肌細(xì)胞融合需要重構(gòu)肌動(dòng)蛋白
        3.4 .ADF家族在肌動(dòng)蛋白重構(gòu)中發(fā)揮重要作用
    4.骨骼肌發(fā)育相關(guān)miRNA
        4.1 .miRNA的調(diào)控機(jī)制
        4.2 .骨骼肌發(fā)育中的miRNA
        4.3 .miR-499-5p促進(jìn)慢肌纖維形成
    5.豬肌肉miRNA組學(xué)及關(guān)聯(lián)分析研究進(jìn)展
        5.1 .豬肌肉miRNA組學(xué)研究進(jìn)展
        5.2 .豬肌肉聯(lián)合多組學(xué)分析miRNA的研究進(jìn)展
        5.3 .其他物種的多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析研究
    6.目的與意義
第二章 豬miRNA文庫構(gòu)建及高通量測(cè)序分析
    1.前言
    2.試驗(yàn)材料
        2.1 .試驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 .主要儀器和設(shè)備
        2.3 .主要試劑
        2.4 .常用試劑配制
        2.5 .生物信息學(xué)分析
        2.6 .生物技術(shù)服務(wù)
    3.試驗(yàn)方法
        3.1 .RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)
            3.1.1 .RNA提取
            3.1.2 .RNA質(zhì)量檢測(cè)
        3.2 .建立文庫及測(cè)序
        3.3 .測(cè)序結(jié)果注釋
            3.3.1 .測(cè)序數(shù)據(jù)過濾
            3.3.2 .比對(duì)與注釋
            3.3.3 .miRNA表達(dá)量的計(jì)算
        3.4 .聚類分析
            3.4.1 .主成分分析
            3.4.2 .熱圖聚類分析
        3.5 .功能富集分析
            3.5.1 .靶基因預(yù)測(cè)
            3.5.2 .GO功能富集分析
            3.5.3 .KEGG通路富集分析
        3.6 .miRNA時(shí)序性表達(dá)分析
        3.7 .差異分析
        3.8 .實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            3.8.1 .RNA反轉(zhuǎn)錄
            3.8.2 .引物設(shè)計(jì)及退火溫度的確定
            3.8.3 .實(shí)時(shí)熒光定量
    4.結(jié)果與分析
        4.1 .原始數(shù)據(jù)
            4.1.1 .文庫的建立
            4.1.2 .測(cè)序原始數(shù)據(jù)
        4.2 .miRNA特征分析
            4.2.1 .長度分布
            4.2.2 .基因組定位
            4.2.3 .注釋分類
        4.3 .miRNA分類及靶基因預(yù)測(cè)
            4.3.1 .miRNA分類
            4.3.2 .miRNA靶基因預(yù)測(cè)
        4.4 .miRNA表達(dá)量及高表達(dá)miRNA的功能富集分析
        4.5 .聚類分析
            4.5.1 .PCA聚類
            4.5.2 .熱圖聚類
        4.6 .miRNA時(shí)序性表達(dá)分析及功能注釋
        4.7 .差異表達(dá)miRNA及功能注釋
            4.7.1 .不同發(fā)育階段差異表達(dá)miRNA分析
            4.7.2 .品種間差異表達(dá)miRNA分析
        4.8 .測(cè)序數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證
    5.討論
第三章 miRNA組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的整合分析及驗(yàn)證
    1.前言
    2.試驗(yàn)材料
        2.1 .載體、菌株、細(xì)胞
        2.2 .主要儀器和設(shè)備
        2.3 .主要試劑耗材
        2.4 .常用試劑配制
        2.5 .數(shù)據(jù)庫與分析軟件
        2.6 .生物技術(shù)服務(wù)
    3.試驗(yàn)方法
        3.1 .miRNA與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
            3.1.1 .篩選差異差異miRNA-差異表達(dá)靶基因?qū)?br>        3.2 .網(wǎng)絡(luò)互作分析及繪圖
        3.3 .轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        3.4 .功能富集分析
        3.5 .miRNA與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        3.6 .靶基因3’UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建
            3.6.1 .引物設(shè)計(jì)
            3.6.2 .T 載體質(zhì)粒構(gòu)建
            3.6.3 .雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建
            3.6.4 .突變型雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建
        3.7 .細(xì)胞培養(yǎng)
        3.8 .細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.9 .雙熒光素酶活性的測(cè)定
    4.結(jié)果與分析
        4.1 .miRNA與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
            4.1.1 .不同發(fā)育階段miRNA與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
            4.1.2 .不同品種miRNA與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
        4.2 .轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        4.3 .miRNA與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析
        4.4 .三對(duì)豬miRNA與靶基因驗(yàn)證
        4.5 .三對(duì)小鼠miRNA與靶基因驗(yàn)證
    5.討論
第四章 miR-499-5p的功能驗(yàn)證
    1.前言
    2.試驗(yàn)材料
        2.1 .細(xì)胞
        2.2 .主要儀器和設(shè)備
        2.3 .主要試劑耗材
        2.4 .常用試劑配制
        2.5 .數(shù)據(jù)庫與分析軟件
        2.6 .生物技術(shù)服務(wù)
    3.試驗(yàn)方法
        3.1 .細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        3.2 .RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)
        3.3 .實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            3.3.1 .莖環(huán)引物法RNA反轉(zhuǎn)錄
            3.3.2 .莖環(huán)引物設(shè)計(jì)及退火溫度的確定
            3.3.3 .實(shí)時(shí)熒光定量
        3.4 .免疫熒光檢測(cè)
        3.5 .細(xì)胞周期檢測(cè)
        3.6 .細(xì)胞遷移檢測(cè)
        3.7 .細(xì)胞凋亡檢測(cè)
    4.結(jié)果與分析
        4.1 .miR-499-5p轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控DSTN
            4.1.1 .miR-499-5p不影響DSTN的 mRNA水平
            4.1.2 .miR-499-5p抑制DSTN蛋白表達(dá)
        4.2 .miR-499-5p促進(jìn)細(xì)胞遷移
        4.3 .miR-499-5p提高G0、G1 期細(xì)胞比例
        4.4 .分化的啟動(dòng)不能缺少miR-499-5p
        4.5 .miR-499-5p表達(dá)水平異常促進(jìn)細(xì)胞凋亡
    5.討論
第五章 總結(jié)
    1.本研究的主要結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
    2.本研究的不足之處與后續(xù)研究建議
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表論文情況
致謝



本文編號(hào)：3793474