鴨坦布蘇病毒(duck tembusu virus, DTMUV),是黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒,其基因組編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、外膜蛋白PrM/M與囊膜蛋白E)與七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B與NS5)。DTMUV感染鴨群后主要引起鴨產(chǎn)蛋驟然大幅下降,該病傳播迅速,給我國(guó)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。DTMUV囊膜(Envelope, E)蛋白是病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白,含有多個(gè)抗原決定簇,能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,引起宿主產(chǎn)生保護(hù)性的免疫應(yīng)答,同時(shí)E蛋白也在DTMUV復(fù)制過(guò)程中起一定的作用。 本研究對(duì)一株鴨坦布蘇病毒的全基因組序列進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析,并對(duì)病原的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,包括多聚蛋白的剪切位點(diǎn)、半胱氨酸的分布、潛在的糖基化位點(diǎn)以及3’UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)；然后以DTMUV HN株為基礎(chǔ)毒株,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增E基因,用原核表達(dá)載體pET-30a(+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,命名為pET-E,通過(guò)pET-E表達(dá)的E蛋白經(jīng)由切膠的方法進(jìn)行純化；利用純化的DTMUV HN株E蛋白免疫6周齡雌性BALB/c小鼠,制備免疫小鼠的脾細(xì)胞,與骨...

【文章頁(yè)數(shù)】：45 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
碩士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)簽名表 摘要 Abstract 英文縮略表 第一章 引言
1.1 鴨坦布蘇病毒病概述
1.2 鴨坦布蘇病毒病的病原學(xué)特征
    1.2.1 鴨坦布蘇病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)
    1.2.2 鴨坦布蘇病毒的理化特性
    1.2.3 鴨坦布蘇病毒的培養(yǎng)特性
    1.2.4 鴨坦布蘇病毒的基因組及其編碼的蛋白質(zhì)
1.3 鴨坦布蘇病毒病的流行病學(xué)特征
1.4 鴨坦布蘇病毒病的診斷
    1.4.1 臨床癥狀
    1.4.2 病理變化
    1.4.3 病毒的分離與鑒定
    1.4.4 鴨坦布蘇病毒病的病原學(xué)診斷
    1.4.5 鴨坦布蘇病毒病的血清學(xué)診斷
1.5 鴨坦布蘇病毒病的防治
1.6 研究目的與意義 第二章 鴨坦布蘇病毒HN株基因組序列分析
2.1 材料
    2.1.1 病毒、菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.1.2 主要試劑
    2.1.3 實(shí)驗(yàn)所需儀器
2.2 方法
    2.2.1 病毒來(lái)源
    2.2.2 RT-PCR和測(cè)序
    2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析
    2.2.4 多聚蛋白剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)
    2.2.5 3'UTR與環(huán)狀序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)
2.3 結(jié)果
    2.3.1 HN株全基因組序列特征
    2.3.2 3'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)
    2.3.3 剪切位點(diǎn)、半胱氨酸殘基分布及潛在糖基化位點(diǎn)
    2.3.4 HN株與其它黃病毒的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
2.4 討論 第三章 DTMUV E蛋白的原核表達(dá)及鑒定
3.1 材料
    3.1.1 病毒、載體、菌株及血清
    3.1.2 主要試劑
    3.1.3 實(shí)驗(yàn)所需儀器
    3.1.4 引物設(shè)計(jì)
3.2 方法
    3.2.1 DTMUV RNA的提取及cDNA的獲得
    3.2.2 DTMUV E基因的PCR擴(kuò)增
    3.2.3 PCR產(chǎn)物的膠回收
    3.2.4 目的基因克隆與鑒定
    3.2.5 原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建及鑒定
    3.2.6 E蛋白的原核表達(dá)及SDS-PAGE分析
    3.2.7 E蛋白的純化
    3.2.8 E蛋白的免疫原性鑒定
3.3 結(jié)果
    3.3.1 E基因擴(kuò)增
    3.3.2 pMD18-T-E的酶切鑒定
    3.3.3 重組質(zhì)粒pET-E的酶切鑒定
    3.3.4 蛋白的SDS-PAGE分析
    3.3.5 E蛋白的Western-blot鑒定
3.4 討論 第四章 抗DTMUV E蛋白單克隆抗體的制備及鑒定
4.1 材料
    4.1.1 病毒株、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    4.1.2 主要試劑及耗材
    4.1.3 儀器設(shè)備
4.2 方法
    4.2.1 動(dòng)物免疫
    4.2.2 間接ELISA篩選方法的建立
    4.2.3 小鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備
    4.2.4 細(xì)胞的融合
    4.2.5 陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選
    4.2.6 單克隆抗體的鑒定
4.3 結(jié)果
    4.3.1 篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞方法的建立
    4.3.2 Dot-ELISA鑒定結(jié)果
    4.3.3 Western blot鑒定結(jié)果
    4.3.4 IFA鑒定結(jié)果
4.4 討論 第五章 全文結(jié)論 參考文獻(xiàn) 致謝 作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3790892