為了對產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素進(jìn)行快速、有效的檢測,本研究以單克隆抗體(MonoclonalAntibody,mAb)為基礎(chǔ),建立了雙抗體夾心ELISA(DoubleAntibody Sandwich ELISA,DAS-ELISA)方法。純化原核表達(dá)的α毒素蛋白為免疫原,利用雜交瘤技術(shù)獲得3株穩(wěn)定分泌α毒素mAb的細(xì)胞株制備腹水型mAb,并分離純化作為檢測抗體,免疫新西蘭大白兔制各抗α毒素多克隆抗體純化后作為捕獲抗體,通過試驗優(yōu)化反應(yīng)條件,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;并對建立的DAS-ELISA方法進(jìn)行性能評價及初步應(yīng)用。DAS-ELISA方法對α毒素的有效檢測范圍為5.86³75ng/mL,最低檢測線為4.57ng/mL,比多抗-多抗雙夾心ELISA有更高的特異性和敏感性。初步應(yīng)用結(jié)果顯示,相同培養(yǎng)條件下,本實驗保存的A-E型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的不同培養(yǎng)上清中,α毒素含量差異較大,A型菌(NCTC528)中α毒素含量顯著高于其他菌型。本研究成功制備了高特異性的mAb,并建立了特異、靈敏、穩(wěn)定的DAS-ELISA方法,為高效檢測α毒素提供了有效工具。

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