采食量直接決定動物能夠從環(huán)境中獲得多少營養(yǎng)物質(zhì),它是評價動物營養(yǎng)物質(zhì)需求和能量代謝的基礎(chǔ),而生理因素是影響動物采食量的最根本的因素。研究表明,在下丘腦食欲調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有許多促進(jìn)食欲和抑制食欲的調(diào)控因子,PYY就是其中之一。PYY在食欲和機(jī)體肥胖上面有重要的調(diào)控作用,動物減少采食后pYY的釋放增加,顯示食欲增強(qiáng),并與肥胖呈負(fù)相關(guān),對PYY的調(diào)控可能是機(jī)體控制食欲的重要途徑。因此,本研究從PYY基因的表觀遺傳調(diào)控入手,電子克隆豬PYY基因,找尋能夠引起PYY基因3’UTR潛在miRNA結(jié)合位點發(fā)生改變的SNP,并加以驗證,同時探討了PYY基因5’側(cè)翼序列的甲基化狀態(tài),初步解析了miR-652與PYY之間的作用關(guān)系以及PYY甲基化狀態(tài),為PYY調(diào)控豬采食量進(jìn)一步提供了理論基礎(chǔ),并為利用PYY進(jìn)行采食量控制的具體應(yīng)用提供素材。取得的結(jié)果如下： 1. q-PCR組織表達(dá)譜結(jié)果顯示：PYY基因在大白和梅山豬胃、十二指腸中的表達(dá)量明顯比在腦、心等組織中要高,并且梅山豬各組織中PYY的表達(dá)量均高于大白豬；梅山30日齡、75日齡和275日齡在十二指腸和胃中PYY基因呈現(xiàn)逐漸升高的表達(dá)趨勢,并且十二指腸中的...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 PYY功能以及研究進(jìn)展
        1.1 多肽家族中的PYY
        1.2 PYY基因定位
        1.3 PYY在機(jī)體內(nèi)的功能
        1.4 PYY偏愛的受體
    2 SNP概述
        2.1 SNP的分類
        2.2 SNP的檢測方法
    3 MIRNA的功能和研究進(jìn)展
        3.1 miRNA的研究方法
        3.2 miRNA的生物合成過程
        3.3 miRNA的作用機(jī)制
    4 DNA甲基化功能與機(jī)制研究進(jìn)展
        4.1 DNA甲基化的生物學(xué)功能
        4.2 DNA甲基化檢測方法
        4.3 甲基轉(zhuǎn)移模式
    5 本試驗的目的和意義
第二章 材料與方法
    1 試驗材料
        1.1 細(xì)胞樣品
        1.2 組織樣本
            1.2.1 提取全基因組DNA樣品
            1.2.2 提取總RNA組織樣
        1.3 載體和菌株
        1.4 主要儀器與設(shè)備
        1.5 主要的試劑與藥品
        1.6 主要試劑的配置
        1.7 主要的分子生物學(xué)軟件和網(wǎng)站
    2 試驗方法
        2.1 血液、組織DNA提取
        2.2 組織、細(xì)胞總RNA提取
        2.3 cDNA的制備
        2.4 PYY基因表達(dá)譜分析
        2.5 序列擴(kuò)增尋找SNP
            2.5.1 引物設(shè)計
            2.5.2 PCR擴(kuò)增體系、條件
            2.5.3 瓊脂糖凝膠電泳、膠回收
            2.5.4 連接
            2.5.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.5.6 陽性克隆的篩選及測序
            2.5.7 測序結(jié)果分析和對比
        2.6 豬PYY基因3’UTR序列的克隆和重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
            2.6.1 引物設(shè)計
            2.6.2 雙酶切
            2.6.3 連接
            2.6.4 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)鑒定
            2.6.5 質(zhì)粒的抽提及酶切鑒定
            2.6.6 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.6.7 瞬時轉(zhuǎn)染
            2.6.8 熒光素酶相對活性測定與分析
        2.7 構(gòu)建突變型載體
            2.7.1 引物設(shè)計
            2.7.2 PCR擴(kuò)增
        2.8 Western Blot驗證
            2.8.1 蛋白濃度測定
            2.8.2 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.8.3 免疫反應(yīng)
            2.8.4 ECL化學(xué)發(fā)光檢測
        2.9 DNA甲基化
            2.9.1 CpG島預(yù)測
            2.9.2 甲基化分析模板DNA的處理
            2.9.3 PCR擴(kuò)增及克隆、測序
第三章 結(jié)果與分析
    1 豬PYY基因組織表達(dá)譜分析
        1.1 總RNA的提取和質(zhì)量控制
        1.2 cDNA的合成和質(zhì)量檢測
        1.3 梅山、大白豬PYY組織表達(dá)譜
        1.4 豬PYY基因在梅山豬30日齡、75日齡和275日齡十二指腸和胃中的表達(dá)分析
        1.5 豬PYY基因在大白豬3日齡、30日齡和120日齡十二指腸和胃中的表達(dá)分析
    2 大白和梅山豬PYY基因3’UTR擴(kuò)增和SNP尋找
        2.1 豬PYY基因3’UTR序列的克隆
        2.2 大白和梅山豬PYY基因3’UTR序列對比
    3 MIR-652對靶基因調(diào)控研究
        3.1 與靶基因綁定的microRNA預(yù)測
        3.2 豬PYY基因3’UTR序列的克隆及酶切回收
        3.3 熒光素酶報告載體的構(gòu)建以及檢測結(jié)果
            3.3.1 野生型熒光素酶報告載體的構(gòu)建
            3.3.2 miR-652 mimic轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞活性分析
        3.4 突變型熒光素酶報告載體構(gòu)建以及檢測結(jié)果
            3.4.1 突變載體構(gòu)建
            3.4.2 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果
        3.5 轉(zhuǎn)染后PK細(xì)胞中PYY基因定量分析
        3.6 Westernblot檢測PYY蛋白水平的表達(dá)
    4 豬PYY基因5’側(cè)翼序列甲基化的研究
        4.1 豬PYY基因5’側(cè)翼序列CpG島預(yù)測
        4.2 含有CpG島片段的擴(kuò)增
        4.3 PYY基因5’側(cè)翼CpG島甲基化分析
第四章 討論
    4.1 豬PYY基因組織表達(dá)譜分析
    4.2 豬PYY基因3’UTR中的SNP
    4.3 MIR-652對PYY基因的調(diào)控
    4.4 豬PYY基因5’側(cè)翼甲基化分析
第五章 小結(jié)
    5.1 本試驗主要結(jié)論
    5.2 本研究的特色與創(chuàng)新點
    5.3 本研究的不足以及下一步的工作建議
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3788676