乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬黃病毒科黃病毒屬,是一種由蚊傳播的人獸共患病病原。黃病毒屬成員還包括WNV、ZIKV、DENV和YFV等可致人和動物感染發(fā)病的病原。JEV感染可以引起人和動物發(fā)病,人與馬感染可引起腦炎,重者可致死亡;母豬感染可致流產(chǎn)與死胎;多數(shù)動物呈隱性感染。JEV主要在東南亞地區(qū)流行,但存在全球性擴散風險。目前還沒有針對JEV的特異性治療方法。為尋找新的潛在性藥物靶位點,需要加深認識病毒復制過程以及與宿主間相互作用機制。研究表明SPCS1是JEV等黃病毒在細胞內復制所需的宿主因子之一,在病毒多聚蛋白剪切加工中發(fā)揮重要作用。為了進一步研究SPCS1分子對JEV復制影響的分子機制。本研究運用多種技術手段分析了SPCS1分子對JEV病毒復制過程中各階段的影響,研究了SPCS1參與JEV病毒復制的分子機制。本研究首先利用siRNA干擾宿主SPCS1基因,驗證了SPCS1分子對JEV復制的正調控作用。再使用CRISPR/Cas9技術敲除SPCS1基因,構建SPCS1基因缺失的HEK-293細胞系(SPCS1 KO HEK-293細...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 JEV分子生物學特性
        1.1.1 JEV物理特性及基因組結構
        1.1.2 JEV結構蛋白功能與特點
        1.1.3 JEV非結構蛋白的功能與特點
    1.2 JEV復制機制研究進展
        1.2.1 病毒的入侵
        1.2.2 病毒基因組的翻譯與復制
        1.2.3 病毒粒子的組裝與釋放
        1.2.4 JEV的致病機制
    1.3 JEV與宿主相互作用研究進展
        1.3.1 JEV蛋白與宿主蛋白的相互作用對病毒復制的影響
        1.3.2 病毒和宿主因子相互作用的研究方法
    1.4 信號肽酶復合體
    1.5 研究的目的和意義
第二章 SPCS1對JEV復制的影響
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要材料、試劑
        2.1.2 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 SIRNA設計合成與轉染
        2.2.2 SIRNA轉染與病毒感染
        2.2.3 間接免疫熒光試驗(IFA)
        2.2.4 高內涵細胞篩選系統(tǒng)成像與分析
        2.2.5 細胞增殖活性檢測
        2.2.6 SPCS1缺失對JEV感染率的影響
        2.2.7 SPCS1缺失對JEV感染致細胞病變影響的觀察
        2.2.8 JEVE蛋白與NS1蛋白的WESTERNBLOT檢測
        2.2.9 病毒效價測定
        2.2.10 SPCS1功能補償實驗
    2.3 實驗結果
        2.3.1 SIRNA干擾SPCS1后降低JEV復制
        2.3.2 JEV對SPCS1KO細胞感染率降低
        2.3.3 JEV對SPCS1KO細胞不造成細胞病變
        2.3.4 SPCS1缺失降低病毒蛋白表達
        2.3.5 SPCS1缺失顯著降低JEV復制水平
        2.3.6 補償SPCS1提高SPCS1KO細胞中JEV復制水平
    2.4 討論
第三章 SPCS1缺失對JEV復制環(huán)節(jié)影響的研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要材料、試劑
        3.1.2 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 穩(wěn)定表達JEVC-PRM-E細胞系的構建
        3.2.2 JEV復制缺陷性病毒的構建和單輪感染能力檢測
        3.2.3 RRPS對HEK-293與SPCS1KOHEK-293細胞入侵性實驗
        3.2.4 反轉錄熒光定量PCR實驗
        3.2.5 WB檢測JEVE蛋白、PRM與NS1蛋白
        3.2.6 電子顯微鏡觀察JEV的子代病毒
        3.2.7 報告型病毒組裝系統(tǒng)分析病毒的組裝
    3.3 實驗結果
        3.3.1 IFA鑒定BJEV-CME細胞系JEVE的表達
        3.3.2 RRPS單輪感染能力檢測
        3.3.3 SPCS1不影響JEV入侵
        3.3.4 SPCS1不影響JEV基因組的復制
        3.3.5 WB鑒定SPCS1不影響JEV蛋白的翻譯
        3.3.6 電子顯微鏡觀察SPCS1影響子代病毒顆粒的組裝
        3.3.7 SPCS1缺失影響病毒組裝
    3.4 討論
第四章 JEVNS2B與SPCS1的相互作用
    4.1 實驗材料
        4.1.1 主要材料、試劑
        4.1.2 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 雙分子熒光互補實驗(BIFC)
        4.2.2 免疫共沉淀
    4.3 實驗結果
        4.3.1 SPCS1與NS2B在細胞中的相互作用
        4.3.2 NS2B的缺失突變與定點突變
        4.3.3 NS2B的跨膜區(qū)與SPCS1具有相互作用
        4.3.4 與SPCS1相互作用的NS2B關鍵位點鑒定
        4.3.5 SPCS1的跨膜區(qū)與NS2B具有相互作用
        4.3.6 BIFC分析JEVNS2B截短突變體與NS2A相互作用區(qū)域
        4.3.7 NS2B與SPCS1、NS2A相互作用模型
    4.4 討論
第五章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3788128