乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬黃病毒科黃病毒屬,是一種由蚊傳播的人獸共患病病原。黃病毒屬成員還包括WNV、ZIKV、DENV和YFV等可致人和動(dòng)物感染發(fā)病的病原。JEV感染可以引起人和動(dòng)物發(fā)病,人與馬感染可引起腦炎,重者可致死亡;母豬感染可致流產(chǎn)與死胎;多數(shù)動(dòng)物呈隱性感染。JEV主要在東南亞地區(qū)流行,但存在全球性擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。目前還沒(méi)有針對(duì)JEV的特異性治療方法。為尋找新的潛在性藥物靶位點(diǎn),需要加深認(rèn)識(shí)病毒復(fù)制過(guò)程以及與宿主間相互作用機(jī)制。研究表明SPCS1是JEV等黃病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所需的宿主因子之一,在病毒多聚蛋白剪切加工中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步研究SPCS1分子對(duì)JEV復(fù)制影響的分子機(jī)制。本研究運(yùn)用多種技術(shù)手段分析了SPCS1分子對(duì)JEV病毒復(fù)制過(guò)程中各階段的影響,研究了SPCS1參與JEV病毒復(fù)制的分子機(jī)制。本研究首先利用siRNA干擾宿主SPCS1基因,驗(yàn)證了SPCS1分子對(duì)JEV復(fù)制的正調(diào)控作用。再使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除SPCS1基因,構(gòu)建SPCS1基因缺失的HEK-293細(xì)胞系(SPCS1 KO HEK-293細(xì)...

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 JEV分子生物學(xué)特性
        1.1.1 JEV物理特性及基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.2 JEV結(jié)構(gòu)蛋白功能與特點(diǎn)
        1.1.3 JEV非結(jié)構(gòu)蛋白的功能與特點(diǎn)
    1.2 JEV復(fù)制機(jī)制研究進(jìn)展
        1.2.1 病毒的入侵
        1.2.2 病毒基因組的翻譯與復(fù)制
        1.2.3 病毒粒子的組裝與釋放
        1.2.4 JEV的致病機(jī)制
    1.3 JEV與宿主相互作用研究進(jìn)展
        1.3.1 JEV蛋白與宿主蛋白的相互作用對(duì)病毒復(fù)制的影響
        1.3.2 病毒和宿主因子相互作用的研究方法
    1.4 信號(hào)肽酶復(fù)合體
    1.5 研究的目的和意義
第二章 SPCS1對(duì)JEV復(fù)制的影響
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 主要材料、試劑
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 SIRNA設(shè)計(jì)合成與轉(zhuǎn)染
        2.2.2 SIRNA轉(zhuǎn)染與病毒感染
        2.2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)
        2.2.4 高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)成像與分析
        2.2.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)
        2.2.6 SPCS1缺失對(duì)JEV感染率的影響
        2.2.7 SPCS1缺失對(duì)JEV感染致細(xì)胞病變影響的觀察
        2.2.8 JEVE蛋白與NS1蛋白的WESTERNBLOT檢測(cè)
        2.2.9 病毒效價(jià)測(cè)定
        2.2.10 SPCS1功能補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 SIRNA干擾SPCS1后降低JEV復(fù)制
        2.3.2 JEV對(duì)SPCS1KO細(xì)胞感染率降低
        2.3.3 JEV對(duì)SPCS1KO細(xì)胞不造成細(xì)胞病變
        2.3.4 SPCS1缺失降低病毒蛋白表達(dá)
        2.3.5 SPCS1缺失顯著降低JEV復(fù)制水平
        2.3.6 補(bǔ)償SPCS1提高SPCS1KO細(xì)胞中JEV復(fù)制水平
    2.4 討論
第三章 SPCS1缺失對(duì)JEV復(fù)制環(huán)節(jié)影響的研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 主要材料、試劑
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 穩(wěn)定表達(dá)JEVC-PRM-E細(xì)胞系的構(gòu)建
        3.2.2 JEV復(fù)制缺陷性病毒的構(gòu)建和單輪感染能力檢測(cè)
        3.2.3 RRPS對(duì)HEK-293與SPCS1KOHEK-293細(xì)胞入侵性實(shí)驗(yàn)
        3.2.4 反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
        3.2.5 WB檢測(cè)JEVE蛋白、PRM與NS1蛋白
        3.2.6 電子顯微鏡觀察JEV的子代病毒
        3.2.7 報(bào)告型病毒組裝系統(tǒng)分析病毒的組裝
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 IFA鑒定BJEV-CME細(xì)胞系JEVE的表達(dá)
        3.3.2 RRPS單輪感染能力檢測(cè)
        3.3.3 SPCS1不影響JEV入侵
        3.3.4 SPCS1不影響JEV基因組的復(fù)制
        3.3.5 WB鑒定SPCS1不影響JEV蛋白的翻譯
        3.3.6 電子顯微鏡觀察SPCS1影響子代病毒顆粒的組裝
        3.3.7 SPCS1缺失影響病毒組裝
    3.4 討論
第四章 JEVNS2B與SPCS1的相互作用
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 主要材料、試劑
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BIFC)
        4.2.2 免疫共沉淀
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 SPCS1與NS2B在細(xì)胞中的相互作用
        4.3.2 NS2B的缺失突變與定點(diǎn)突變
        4.3.3 NS2B的跨膜區(qū)與SPCS1具有相互作用
        4.3.4 與SPCS1相互作用的NS2B關(guān)鍵位點(diǎn)鑒定
        4.3.5 SPCS1的跨膜區(qū)與NS2B具有相互作用
        4.3.6 BIFC分析JEVNS2B截短突變體與NS2A相互作用區(qū)域
        4.3.7 NS2B與SPCS1、NS2A相互作用模型
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3788128