近年來,由于毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系統(tǒng)在細菌和古生菌基因組中大量的廣泛存在,然對其生理功能的認識卻十分有限,因此引起了越來越多的關注。TA系統(tǒng)最初發(fā)現于大腸桿菌低拷貝質粒中,利用一種稱為是“分裂后殺傷機制”或“成癮模塊”的機制發(fā)揮質粒的穩(wěn)定性功能。TA系統(tǒng)在影響細菌自身的生長調控、生物被膜的形成、毒力或其他不利條件的應激反應中發(fā)揮重要作用。這些模塊已經在大腸桿菌和其他各種細菌中被鑒定,但其功能尚需進行深入研究。此外,TA系統(tǒng)存在于豬鏈球菌(Streptococcus suis)這一重要人獸共患病原菌基因組中,卻鮮有報道。盡管目前關于豬鏈球菌致病性的研究有很多,但對其發(fā)病機制的認識仍然非常有限。因此,在本研究中,我們主要開展了豬鏈球菌2型yefM-yoeB TA系統(tǒng)的鑒定和功能研究,來探討TA系統(tǒng)與豬鏈球菌致病性的關系。具體研究內容如下:1.豬鏈球菌2型毒素-抗毒素系統(tǒng)yefM-yoeB的鑒定生物信息學分析顯示豬鏈球菌2型YefM和YoeB與大腸桿菌、肺炎鏈球菌的具有極高的同源性,且yefM-yoeB染色體位點存在于豬鏈球菌的大多數血清型菌株的基因組中。過量...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 文獻綜述
    1.1 豬鏈球菌概述
        1.1.1 豬鏈球菌的流行病學
        1.1.2 豬鏈球菌病的治療和防控
        1.1.3 豬鏈球菌毒力因子相關的致病性研究進展
    1.2 毒素-抗毒素系統(tǒng)
        1.2.1 毒素-抗毒素系統(tǒng)具有重要的生物學功能
        1.2.2 毒素-抗毒素系統(tǒng)影響細菌致病性
        1.2.3 毒素-抗毒素系統(tǒng)調控生物膜形成
        1.2.4 毒素-抗毒素系統(tǒng)調控持留菌形成
        1.2.5 毒素-抗毒素系統(tǒng)調控細菌的適應性
        1.2.6 毒素-抗毒素系統(tǒng)的發(fā)展前景
    1.3 Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)
        1.3.1 Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)的種類
        1.3.2 Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)的研究進展
        1.3.3 豬鏈球菌Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)
2 研究目的與意義
3 實驗材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株、質粒和培養(yǎng)條件
        3.1.2 實驗相關試劑
        3.1.3 本研究所用引物
        3.1.4 實驗動物和細胞
    3.2 實驗方法
        3.2.1 豬鏈球菌2 型基因組DNA的提取
        3.2.2 豬鏈球菌2型RNA的提取、RT-PCR和 qRT-PCR
        3.2.3 重組質粒的構建
        3.2.4 大腸桿菌生長曲線的測定
        3.2.5 YefM-YoeB蛋白的克隆、表達和純化
        3.2.6 小鼠血清抗體的制備和Western blot檢測
        3.2.7 抗毒素或毒素-抗毒素復合物對TA操縱子的自動調節(jié)
        3.2.8 豬鏈球菌2 型基因缺失突變株的構建
        3.2.9 互補菌株C?yefM-yoeB的構建
        3.2.10 突變株、野生株和互補菌株的生物學特性研究
        3.2.11小鼠感染實驗
        3.2.12 豬全血殺菌實驗
        3.2.13 毒素-抗毒素定點突變
        3.2.14 在不同條件下生長曲線的測定
        3.2.15 BALB/c小鼠感染實驗
        3.2.16 細胞實驗
        3.2.17 統(tǒng)計分析
4 結果與分析
    4.1 豬鏈球菌2型YEFM-YOEB II型毒素-抗毒素系統(tǒng)的鑒定
        4.1.1 生物信息學分析
        4.1.2 YoeB、YefM、YefM-YoeB對大腸桿菌的生長影響
        4.1.3 豬鏈球菌YoeB的毒性作用
        4.1.4 引入豬鏈球菌yefM-yoeB影響大腸桿菌生長
        4.1.5 毒素抗毒素形成復合物
        4.1.6 毒素抗毒素系統(tǒng)的自我調控
    4.2 豬鏈球菌2 型缺失毒素-抗毒素系統(tǒng)YEFM-YOEB的影響
        4.2.1 自殺性重組載體的構建和鑒定
        4.2.2 豬鏈球菌2型yoeB基因缺失突變株的鑒定
        4.2.3 豬鏈球菌2型yefM-yoeB基因缺失突變株和互補菌株的篩選與鑒定
        4.2.4 突變株和野生株體外生長特性的比較
        4.2.5 突變株和野生株的溶血活性比較
        4.2.6 突變株和野生株的耐藥性檢測
        4.2.7 豬鏈球菌2 型缺失yefM-yoeB對小鼠的致病力的影響
        4.2.8 缺失yefM-yoeB影響豬鏈球菌2 型在豬全血中的增殖情況
    4.3 毒素-抗毒素蛋白相互作用的關鍵位點
        4.3.1 YefM-YoeB蛋白結構解析
        4.3.2 YoeB活性位點的驗證
        4.3.3 YefM點突變影響大腸桿菌的生長
        4.3.4 YefM點突變影響豬鏈球菌2 型的生長
        4.3.5 YefM點突變影響豬鏈球菌2 型的應激反應
        4.3.6 YefM點突變影響豬鏈球菌2 型在小鼠體內的存活
        4.3.7 YefM點突變后影響細胞毒性
5 討論
    5.1 課題的選擇
    5.2 豬鏈球菌2 型毒素YoeB可以被同源YefM_Ssu和異源YefM_Spn中和,不被YefM_Eco中和
    5.3 豬鏈球菌2 型毒素-抗毒素yefM-yoeB影響大腸桿菌生長
    5.4 YefM-YoeB蛋白的表達問題及豬鏈球菌2 型缺失抗毒素基因致死原因
    5.5 豬鏈球菌2 型毒素-抗毒素系統(tǒng)yefM-yoeB對抗生素耐藥性的影響
    5.6 小鼠模型評價豬鏈球菌2型毒素-抗毒素系統(tǒng)缺失的致病性問題
    5.7 YefM-YoeB晶體解析及相互作用的關鍵位點影響豬鏈球菌2 型的氧化應激能力和致病性
6 結論與展望
參考文獻
附錄
    補充材料
    個人簡歷
致謝



本文編號：3787925