本研究對(duì)DPV UL22基因進(jìn)行了分子特性分析、克隆、原核表達(dá)、蛋白純化、多克隆抗體的制備、細(xì)胞內(nèi)的定位及真核表達(dá)研究,獲如下結(jié)果：1.鴨瘟病毒UL22基因的生物信息學(xué)分析通過生物信息學(xué)分析工具對(duì)UL22基因核苷酸序列、編碼蛋白gH及與其它皰疹病毒的同源性作了分析。結(jié)果表明UL22基因?yàn)?505bp,分子量92.5433kDa,編碼834個(gè)氨基酸,有一條信號(hào)肽和兩個(gè)跨膜區(qū),還含有8個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和52個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn),抗原位點(diǎn)較多,gH蛋白的分子之間形成了三個(gè)二硫鍵。同源性分析表明gH蛋白在皰疹病毒中是非常保守的,且與馬立克病毒屬的MeHV-1.GaHV-2和GaHV-3 UL22基因的同源性最高。2.鴨瘟病毒截段基因的原核表達(dá)及抗體的制備根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,去除掉gH蛋白的信號(hào)肽和跨膜區(qū)得到了截段形式的gHt基因,構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32c(+)-gHt,轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21后在37℃、0.2mmol/L IPTG及10h誘導(dǎo)條件下,得到gHt蛋白,該蛋白主要存在于包涵體。純化的gHt蛋白免疫兔子制備的高免血清效價(jià)達(dá)到1：32,Western blot證實(shí)gHt蛋白可...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞及符號(hào)表
一、引言
    1 皰疹病毒UL22基因及其編碼糖蛋白gH的研究進(jìn)展
        1.1 皰疹病毒的基本特征
        1.2 UL22基因序列及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
            1.2.1 UL22基因序列特點(diǎn)
            1.2.2 糖蛋白gH的特點(diǎn)
            1.2.3 糖蛋白gH的功能域
        1.3 皰疹病毒糖蛋白gH的功能
            1.3.1 介導(dǎo)病毒的入侵和細(xì)胞間的傳播
            1.3.2 在膜融合過程中的作用
            1.3.3 抗原性
            1.3.4 抗病毒作用
        1.4 皰疹病毒糖蛋白gH與其它蛋白的相互作用
            1.4.1 糖蛋白gH和gL的相互作用
            1.4.2 糖蛋白gH與gE的相互作用
            1.4.3 第三蛋白與gH/gL復(fù)合體的相互作用
        1.5 展望
    2 選題目的及意義
二、實(shí)驗(yàn)研究
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 基因序列
        1.2 毒株、菌種、載體及細(xì)胞
        1.3 主要試劑
        1.4 主要試劑的配制
        1.5 主要儀器
        1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 DPV UL22基因序列及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析
            2.1.1 DPV UL22基因的核苷酸序列分析
            2.1.2 DPV UL22基因編碼蛋gH的生物信息學(xué)分析
            2.1.3 同源性分析
        2.2 DPV UL22基因的克隆表達(dá)、蛋白純化及多抗制備
            2.2.1 DPV UL22基因的克隆
            2.2.2 UL22截段基因gHt重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.3 重組蛋白gHt的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
            2.2.4 重組蛋白gHt的純化及鑒定
            2.2.5 兔抗DPV gHt多克隆抗體的制備
        2.3 DPV UL22編碼蛋白gH在感染DEF中的定位分析
            2.3.1 間接免疫熒光檢測(cè)DPV gH蛋白在DEF的定位
            2.3.2 gH蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位的動(dòng)態(tài)分析
        2.4 DPV gH和gHt真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析
            2.4.1 DPV UL22基因和UL22截段基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.4.2 HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)
            2.4.3 重組質(zhì)粒pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞
            2.4.4 重組質(zhì)粒的表達(dá)分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 DPV UL22基因序列及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果
            3.1.1 DPV UL22基因的核苷酸序列分析結(jié)果
            3.1.2 DPV UL22基因編碼蛋白gH的生物信息學(xué)分析結(jié)果
            3.1.3 同源性分析結(jié)果
        3.2 DPV UL22基因的克隆表達(dá)、蛋白純化及多抗制備結(jié)果
            3.2.1 DPV UL22基因及截段UL22基因的克隆與鑒定
            3.2.2 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32c(+)-gHt的構(gòu)建與鑒定
            3.2.3 gHt的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
            3.2.4 重組蛋白gHt的純化與鑒定
            3.2.5 多抗的制備與鑒定
        3.3 DPV UL22編碼蛋白gH在感染DEF中的定位分析
            3.3.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果
            3.3.2 DPV gH蛋白在感染病毒的宿主細(xì)胞中的定位分析及動(dòng)態(tài)檢測(cè)
        3.4 DPV gH和gHt真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析
            3.4.1 重組質(zhì)粒pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt的構(gòu)建及鑒定
            3.4.2 重組質(zhì)粒pCMV-HA-gH和pCMV-HA-gHt的表達(dá)分析
    4 分析討論
        4.1 DPV UL22基因序列及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析
        4.2 DPV UL22基因的克隆表達(dá)、蛋白純化及多抗制備
            4.2.1 引物的設(shè)計(jì)
            4.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.2.3 蛋白的表達(dá)、純化及多抗的制備
        4.3 DPV UL22編碼蛋白gH在感染DEF中的定位分析
        4.4 DPV gH和gHt真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析
三、結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介及攻讀碩士學(xué)位期間學(xué)術(shù)論文發(fā)表



本文編號(hào)：3785581